雅酶：Western blot 上样量多少才对？看完这 4 组实拍图你就懂了
小雅最近接到几起WB“异常报案”：
有的条带拖尾，相邻泳道信号挤作一团
有的增加上样量，信号却没按预期增强
这些现象看似毫不相干
小雅逐一排查后
却发现问题都指向同一环节——
凭着多年“办案”经验
小雅明白，要理清蛋白上样引发的异常
得先回答两个问题
没处理好的样本有何“可疑特征”？
上样量又该锁定在多少才合适？
今天，咱们就从这两个问题入手
把蛋白上样的门道讲清楚
先看看，处理不合格的样本是个什么样
翻开案卷，会发现很多“报案人”都提到样本黏稠，上样时样本拉丝，难以顺利沉入点样孔。还没开始电泳，异常就已经露了面，这正是样本不合格的典型特征之一（图1）。
图1 上样时样本拉丝、无法快速下沉
案卷分析
样本黏稠，多半是核酸等杂质在“捣乱”。要是直接上样电泳，它们就会干扰蛋白正常迁移，转印膜上可能会冒出位置诡异、形状奇怪的“鬼带”。
小雅对黏稠样本进行了低温超声，离心取上清，咱们再来对比下处理前后的电泳与WB结果，如图2所示。
图2 超声样本vs黏稠样本电泳及WB实测图
a.免染胶电泳实测图；b.WB实测图
样本：HeLa细胞裂解液
上样量梯度：2.5、5、10、15、20μg
结论：上样量增大后，黏稠样本中累积的核酸等物质也随之增加，对蛋白迁移的阻碍效应被放大，导致黏稠样本较大上样量（15、20μg）电泳时，出现孔内残留、拖尾、WB结果出现“鬼带”；而超声样本各上样量条带都锐利平整，信号均匀稳定。
上样量多少才合适？
先理解胶的“承载上限”
另一份案卷中，“报案人”的样本虽然澄清均一，不黏稠，可50μg上样，条带却仍有拖尾。
案卷分析
上样量并非越大越好——单位面积凝胶对蛋白的承载量有限。一味增加上样量，突破凝胶的承载上限，蛋白便会向泳道两侧溢出，挤占泳道间隙。
若恰逢WB信号本身较强，则更棘手：相邻泳道条带会连成一片，难以分辨。上样过载还会诱发拖尾，干扰后续结果分析。咱们来看看案卷详情（图3）。
图3 不同蛋白上样量的电泳及WB实测图
a.免染胶电泳实测图；b.WB实测图
样本：HeLa细胞裂解液
上样量梯度：5、10、20、30、40、50μg
结论：即便样本处理充分，上样量一高，条带仍会拖尾——凝胶已经承载不了这么多蛋白，条带自然会出问题。
建议将上样量控制在＜30μg/孔，极低表达丰度的蛋白除外。
一个反直觉的现象：上样
量大，信号并未增强
还有一些“案卷”更耐人寻味：信号不理想时，“报案人”选择增加上样量，结果条带非但没有改善，反而变得更差。为什么会这样？下面这个实验就是一个典型案例
图4 不同蛋白上样量的染膜与WB实测图
a.丽春红染膜实测图；b.WB实测图
样本：HeLa细胞裂解液
泳道1、3、5：上样10μL
泳道2、4、6：上样20μL
抗体：β-tubulin鼠单克隆抗体（货号：LF203）
稀释比：1:5,000
结论：同一样品，增加上样量后，信号并没有如预期变得更清晰，反而出现条带发灰、边界不清的情况。
案卷分析
信号不理想，不一定就是上样量不够，问题也可能出在样本本身。
当样本质量不够理想时，增加上样量可能适得其反。
我们再来看一份案卷
图5 组织样本内参蛋白不同上样量实测图
样本：小鼠肌肉组织
泳道1~6：样本原液
泳道7~12：稀释20倍后的样本
抗体：β-actin鼠单克隆抗体（货号：LF201）
稀释比：1:10,000
结论：同一块凝胶完成WB检测，未稀释的原样本条带发灰松散，无论怎么调整曝光，都得不到紧实锐利的条带；稀释20倍后上样，内参蛋白的条带轮廓清晰、信号紧实。
两份案卷指向同一结论——上样量并不是越大越好，选择适宜的上样量是保障实验成功的关键。
探索笔记
绕了一大圈，其实都在说一件事
合格的样本
合适的上样量
才是WB结果稳定的前提
那怎么才能获得高质量样本呢？
记住这五步
组织要新鲜取材，细胞要状态良好
黏稠样本要冰浴超声，充分裂解，离心后取上清
分装冻存，严禁反复冻融，避免损伤样本
切记要蛋白定量，蛋白浓度推荐调整到1~2mg/mL
上样量建议＜30μg/孔，极低丰度蛋白可酌情调整
WB是个“结果会说话”的实验
条带不正常，别急着怀疑抗体和曝光
先回头看看样本处理和上样量
很多时候
答案就藏在这两个不起眼的环节里
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