Cell Death Detection Kit, 4AF594 TUNEL Assay，货号-规格：FXP141-050-50 tests

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Cell Death Detection Kit, 4AF594 TUNEL Assay，货号-规格：FXP141-050-50 tests

试剂盒组分：

A.TUNEL Equilibration Buffer			5 mL
B. YF594 TUNEL Reaction Buffer			5 × 0.5 mL
C. TdT Enzyme			50 μL
D. Proteinase K (2 mg/mL)			100 μL
E. DNase I (2 U/μL)			13 μL
F. 10 × DNase I Buffer			260 μL

注意：TUNEL Equilibration Buffer 和 TUNEL Reaction Buffer 中含有有毒、致癌成分 Sodium cacodylate trihydrate 和 Cobaltous chloride，使用时请佩戴口罩、手套，接触皮肤后，请立即有大量水冲洗，废液请按有毒物质处理。

描述：

细胞凋亡的一个显著特点是细胞染色体 DNA 的降解，这是一个较普遍的现象。这种降解非常特异并有规律，所产生的不同长度的 DNA 片段约为 180 bp-200 bp 的整数倍，表现为琼脂糖凝胶电泳中呈现特异的梯状 Ladder 图谱，本试剂盒采用 TUNEL 法，应用末端脱氧核糖核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)在凋亡细胞断裂 DNA 的 3´-OH 末端催化掺入 YF594-dUTP 。YF594-dUTP 标记的 DNA 可以用荧光显微镜直接观察或者用流式细胞仪定量。TUNEL 法可以选择性的检测凋亡细胞，而非坏死细胞或因辐照和药物治疗而造成的 DNA 链断裂的细胞。TUNEL 实验中， TdT 酶催化 dUTP 掺入断裂的 DNA 链的 3´-OH 末端。抗原标记的 dUTP（如digoxin-dUTP、生物素-dUTP），因为它可以直接进行原位检测，是一种更快速、直接的检测手段。

实验步骤:

（一）实验前准备

1) PBS 缓冲液（pH7.4）

2) 4%多聚甲醛（in PBS）

3) 牛血清白蛋白(BSA) 或正常的羊、牛血清

4) 70%乙醇（自选）

5) 脱蜡溶剂（石蜡切片样本）

（二）样本准备

细胞或新鲜冰冻组织切片

a. 可选：准备一份阴性对照样本（加入不含 TdT 酶的 TUNEL 反应液）

b. PBS 清洗细胞或组织两次

c. 细胞固定：加入适量 4%多聚甲醛(pH 7.4)溶液，4℃

d. 放置 30min（新鲜冰冻切片不需要此步操作）

e. PBS 清洗细胞两次

f. 通透细胞：加入冰上预冷的 70%乙醇，在-20℃ 孵育 4 小时。细胞能在 70%乙醇中-20℃的条件下保存一周。或者，细胞可用配制于 PBS 中的 0.2% Triton X-100 溶液通透，室温放置 20min。

g. PBS 清洗细胞两次

石蜡组织切片

1) 室温下用二甲苯浸泡石蜡组织切片 2 次，每次 5 min，以彻底脱掉石蜡。注：二甲苯有毒，易挥发，请在通风橱中进行此操作。

2) 室温下，将切片样本浸没于无水乙醇中漂洗 2 次，每次 5 min。

3) 室温下，将切片样本连续浸没在不同浓度梯度的乙醇（95%、90%、80%、70%）中，每种浓度各漂洗 1 次，每次 5 min。

4) 室温下，将切片浸没于纯水中漂洗 1 次，每次 3 min，再将切片浸没于 1×PBS 中漂洗 1 次，每次 3 min，用滤纸小心吸干切片样本周围多余液体。

5) 用免疫组化笔在切片样本周围描绘样品轮廓，以便下游通透与标记。

6) 按 1:100 的比例，将 2 mg/mL 的 Proteinase K 溶液用 1 ×PBS 稀释，使其终浓度为 20 µg/mL。每个样本上滴加 100 µL 稀释好的 Proteinase K 溶液，使溶液覆盖全部样本区域，室温孵育 20 min。（Proteinase K 的孵育时间、温度需根据不同类型组织样本进行优化）。注：蛋白酶 K 可以帮助渗透组织，但延长孵育时间可能导致切片脱落，所以要最优化孵育时间长短。时间一般为10~30 min，4 µm 左右的片子可以用 10 min，但 30 µm 左右的可用 30 min。过长易脱片、过短起不到通透效果。

7) PBS 浸润清洗切片两次，每次 5 min，用滤纸吸去多余的液体，将处理好的样品放在湿盒中保持湿润。注：这一步必须把蛋白酶 K 洗涤干净，否则会严重干扰后续的标记反应。

冰冻组织切片

1) 将冰冻切片放置于室温的片架上，室温 20 min，晾干。

2) 将载玻片浸没在 4%多聚甲醛溶液（in PBS）中，室温固定 30 min。

3) PBS 浸润清洗切片两次，每次 5 min。

4) 用滤纸小心吸干载玻片上样本周围的液体。

5) 按 1:100 的比例，将 2 mg/mL 的 Proteinase K 溶液用 1 ×PBS 稀释，使其终浓度为 20 µg/mL。每个样本上滴加 100 µL 稀释好的 Proteinase K 溶液，使溶液覆盖全部样本区域，室温孵育 10 min。Proteinase K 的孵育时间、温度需根据不同类型组织样本进行优化）。注：蛋白酶 K 可以帮助渗透组织，但延长孵育时间可能导致切片脱落，所以要最优化孵育时间长短。时间一般为10~30 min，4 µm 左右的片子可以用 10 min，但 30 µm 左右的可用 30 min。过长易脱片、过短起不到通透效果。

6) PBS 浸润清洗切片两次，每次 5 min，用滤纸吸去多余的液体，将处理好的样品放在湿盒中保持湿润。

阳性处理(仅阳性对照进行此步骤，其他样品直接进行 TUNEL 反应步骤)

1) 按 1:10 的比例用 ddH2O 将 10 × DNase I Buffer 稀释成 1 × DNase I Buffer 备用。

2) 滴加 100 µL 1 × DNase I Buffer 到已通透的样本上，室温平衡 5 min。3) 用 1 × DNase I Buffer 以 1:100 稀释 DNase I (2 U/μL)，使其为终浓度 20 U/mL 的工作液。

4) 轻轻吸掉多余液体，加入 100 μL 浓度为 20 U/mL DNase I 工作液，室温孵育 10 min。

5) 轻轻吸掉多余液体，PBS 清洗样品 2 次。

TUNEL 反应

1) 每个样本加入 100uL TUNEL 平衡缓冲液，孵育 5min。

2) 预先配制 TUNEL 反应混合液：每个样本需要已加入 1uL TdT 酶的 50uL TUNEL 反应缓冲液。

3) 弃去平衡缓冲液，每个样本加入 50uL TUNEL 反应混合液。

4) 贴壁细胞或组织样本，用盖玻片使缓冲液均匀覆盖样本，37℃恒温避光箱孵育 1 小时。

5) 悬浮细胞，可加入微孔板中，采用微孔板振荡器进行孵育或每隔 15min 温和的震荡反应管，使之充分反应，37℃恒温避光箱孵育 1 小时。

6) 组织样本，用盖玻片使缓冲液均匀覆盖样本。将样本平放于湿盒内，37℃恒温箱孵育 2 小时，湿盒底部铺一张含少量水的纸巾保持湿度。37℃避光孵育 2 h。

7) 去掉反应液，在 1×PBS 的染色缸中浸泡润洗 2 次，每次 5 min。再使用适量配制于 PBS 中的 0.1% Triton X-100，其中含 5 mg/mL BSA 的缓冲液清洗样本 3 次，每次 5 min，以降低背景。8) （可选）复染：每个样本滴加浓度为 2 μg/mL 的 DAPI染液，避光室温孵育 10 min。染色完后，轻轻去掉染液，并将样本在 1×PBS 中浸泡润洗 3 次，每次 5 min。

9)（可选）封片：将样本先纯水浸没 5 min，再放入 70%乙醇浸没 5 min，再 80%乙醇浸没 5 min，90%乙醇浸没 5 min，95%乙醇浸没 5 min，无水乙醇浸没 5 min，最后将切片样本置于染色缸中以新鲜的二甲苯浸泡透明化处理 2 次，每次 5 min。（通风厨中操作）。脱水完成后，擦去切片周围的液体，每个切片样本滴加 50 μL 抗荧光淬灭封片液，盖上盖玻片，用镊子的钝端轻轻敲击盖玻片，去除气泡以使封片完全。