诺扬生物

Cell Death Detection Kit, 4AF555 TUNEL Assay，货号-规格：FXP144-050-50 tests

试剂盒组分：

注意：

A 和 B 中含有有毒成分使用时请佩戴口罩、手套，接触皮肤后，请立即有大量水冲洗，废液请按有毒物质处理。

描述：

细胞凋亡的一个显著特点是细胞染色体 DNA 的降解，这是一个较普遍的现象。这种降解非常特异并有规律，所产生的不同长度的 DNA 片段，本试剂盒采用 TUNEL 法，应用末端脱氧核糖核苷酸转移酶 (Terminal Deoxynucleotidyl Transferase,TdT)在凋亡细胞断裂 DNA 的 3´-OH 末端催化掺入 4AF555-dUTP。

4AF555-dUTP 标记的 DNA 可以用荧光显微镜直接观察或者用流式细胞仪检测。适用于组织样本（石蜡切片，冰冻切片）或细胞。TUNEL 法可以选择性的检测凋亡细胞，而非坏死细胞或因辐照和药物治疗而造成的 DNA 链断裂的细胞。

TUNEL 实验中，TdT 酶催化 dUTP 掺入断裂的 DNA 链的 3’羟基末端。抗原标记的 dUTP（如地高辛-dUTP、生物素-dUTP）可以通过孵育二抗（如抗地高辛抗体或链霉亲和素），然后进行荧光或比色法检测。而最佳的选择是荧光染料标记的 dUTP，因为它可以直接进行原位检测，是一种更快速、直接的检测手段。

实验步骤:

（一）实验前准备

1) PBS 缓冲液（pH7.4）

2) 4%多聚甲醛（in PBS）

3) 牛血清白蛋白(BSA) 或 正常的羊、牛血清

4) 70%乙醇（自选）

5) 脱蜡溶剂（石蜡切片样本）

6) 蛋白酶 K（石蜡切片样本）

（二）样本准备

细胞或新鲜冰冻组织切片

a. 可选：准备一份阴性对照样本（加入不含 TdT 酶的 TUNEL 反应液）

b. PBS 清洗细胞或组织两次

c. 细胞固定：加入适量 4%多聚甲醛(pH 7.4)溶液，4℃放置 30min（新鲜冰冻切片不需要此步操作）

d. PBS 清洗细胞两次

e. 通透细胞：加入冰上预冷的 70%乙醇，在-20℃ 孵育 4 小时。细胞能在 70%乙醇中-20℃的条件下保存一周。或者，细胞可用配制于 PBS 中的 0.2% Triton X-100 溶液通透，室温放置30min。

f. PBS 清洗细胞两次

石蜡组织切片

a. 可选：准备一份阴性对照样本（加入不含 TdT 酶的 TUNEL 反应液）。

b. 按照标准方法进行切片脱蜡和水化处理。

c. PBS 清洗细胞两次。

d. 用 PBS 稀释的终浓度为 20μg/ml 蛋白酶 K 溶液 100μl 透化组织，37℃放置 30min（蛋白酶K 的孵育时间、温度需根据不同类型组织样本进行优化）。

e. PBS 清洗细胞两次，每次 5min。

（三）TUNEL 反应

1) 每个样本加入 100uL TUNEL 平衡缓冲液，孵育 5min。

2) 预先配制 TUNEL 反应混合液：每个样本需要已加入 1uL TdT 酶的 50uL TUNEL 反应缓冲液。

3) 弃去平衡缓冲液，每个样本加入 50uL TUNEL 反应混合液。

a) 贴壁细胞或组织样本，用盖玻片使缓冲液均匀覆盖样本。

b) 悬浮细胞，可加入微孔板中，采用微孔板振荡器进行孵育或每隔 15min 温和的震荡反应管，使之充分反应。

4) 37℃避光孵育 60min，组织样本需要 2h。

5) 300g 离心，去上清，使用适量配制于 PBS 中的 0.1%。Triton X-100，其中含 5 mg/ml BSA的缓冲液清洗样本 3 次。

6) 根据需要进行复染。用荧光显微镜或流式细胞仪观察、分析。4AF555 与 Texas Red 染料的光谱类似，激发波长、发射波长分别为 555nm，565nm。（凋亡细胞应被标记上明亮的红色荧光，没有加入 TdT 酶的阴性对照样本未被标记上荧光）。