Thermo-癌症代谢通路之抗体验证
研究中，代谢重编程是癌细胞的一个指标[1]。即使在有氧的条件下，癌细胞仍然倾向于将葡萄糖代谢成丙酮酸盐、继而有氧糖酵解乳酸(又被称为Warburg effect)，而不是相比之下更有效率的氧化磷酸化途径[2]。这个发现有助于将代谢紊乱与癌症联系起来[3]。
癌症相关代谢特征分为：(1)不受调控的葡萄糖和氨基酸摄入，(2)投机取巧地获取营养，(3)利用糖酵解或三羧酸(TCA)循环的合成中间体，用于生物合成和产生NADPH，(4)氮需求增加，(5)代谢物驱动的基因调节的改变，(6)与微环境有代谢互作。这些代谢的特性中，葡萄糖和谷氨酰胺代谢被广泛研究，其中一些关键蛋白正在被研究是否适用于干预治疗[4,5]。
那么，我们有哪些可用于癌症代谢通路研究，且经过高级验证的Invitrogen抗体呢？
研究已发现，缺氧能够通过激活HIF1-α、GLUT1、HK2、PKM2、PDK、ENO1或LDHA，来增强乳酸的产生和肿瘤的生长。在大多数癌细胞中，PKM2上调，会导致代谢途径重新定向乳酸的产生[6]。
Invitrogen™抗体使用siRNA介导的敲低来减少靶标表达，从而保证了这些抗体的特异性。图1显示了在存在siRNA介导的基因敲除的情况下，使用多种细胞系对Invitrogen™抗LDHA和抗PKM2抗体在Western Blot上的特异性。
图1. LDHA和PKM2抗体特异性的确认
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糖代谢的表观遗传调控，主要通过NAD +依赖的去乙酰化酶家族(SIRT1-7)来进行，特别是SIRT6通过诱导GLUT1、PFK1、ALDOC、PDK1和LDHA的表达，上调葡萄糖代谢。线粒体去乙酰化酶SIRT3起到抑癌作用， SIRT3失活会导致线粒体代谢紊乱 [7] 。图2A和2B显示了使用各种细胞系并在存在siRNA介导的SIRT3敲除的情况下，Invitrogen™抗SIRT3抗体对蛋白质印迹的特异性。
图2. SIRT3和TIGAR抗体特异性的确认
(A)使用各种细胞系的富含膜的提取物进行SIRT3的蛋白质印迹分析。用Invitrogen™SIRT3多克隆抗体(1:1,000稀释,货号PA5-28402)探测印迹， 并使用Invitrogen™山羊抗兔IgG(H + L)二级抗体HRP(0.25 µg / mL，1 :4,000稀释,货号A27036)。观察到对应于SIRT3的29kDa条带 (B)通过使用siRNA介导的SIRT3敲低的蛋白印迹分析确定SIRT3抗体的特异性；密度测定法分析显示，在存在特定siRNA而不是加扰的siRNA的情况下，SIRT3表达降低 (C)使用各种细胞系的全细胞提取物进行TIGAR的WB分析。用Invitrogen™ TIGAR多克隆抗体(1:5,000稀释，货号PA5-29151)进行分析，并使用山羊抗 兔IgG(H + L)二级抗体HRP(0.25 µg / mL,1:4,000稀释) 。 观察到对应于TIGAR的30 kDa条带，在经阿霉素处理的MCF7细胞中TIGAR表达增加。按照图1所述使用iBright成像系统。 |
致癌基因和抑癌基因与癌细胞中葡萄糖代谢的调节有关[8]。TIGAR蛋白（TP53诱导型糖酵解和细胞凋亡调控蛋白）的表达受野生型抑癌基因p53影响上调，导致果糖2，6-二磷酸生成受到抑制，葡萄糖代谢重新导向磷酸戊糖途径[9]。如上图2C显示了使用Western blot，验证了Invitrogen™抗TIGAR抗体在使用和未使用阿霉素处理的MCF7细胞中的特异性。
谷氨酰胺是一种非必需氨基酸，可为TCA循环和脂质生物合成提供碳元素，在许多癌细胞中均观察到谷氨酰胺水平升高的现象。谷氨酰胺酶（GLS）辅助的谷氨酰胺水解会产生包括谷氨酸盐在内的多种代谢产物，随后，谷氨酸脱氢酶（GLUD）将其转化为α-酮戊二酸。致癌基因（例如c-Myc和K-ras），可以激活GLS1和谷氨酸-草酰乙酸转氨酶（GOT），而K-ras能够抑制增殖细胞中的GLUD1，因此这些谷氨酰胺代谢酶已成为潜在的癌症治疗靶点[10]。
图3显示了分别使用免疫荧光和Western blot，验证由siRNA介导的靶基因敲低得到的Invitrogen™抗GLS和抗GLUD抗体的特异性测试。
图3. 谷氨酰胺酶(GLS)和谷氨酸脱氢酶(GLUD)抗体特异性的确认
（A）在HepG2细胞中使用siRNA介导的免疫荧光/免疫细胞化学(IF / ICC)方法证实了Invitrogen™GLS抗体(克隆6H5L15)，ABfinity™兔单克隆抗体(5 µg /mL, 货号701965)的特异性。;siRNA处理的HepG2细胞显示线粒体GLS表达降低。用Invitrogen™山羊抗兔IgG(H + L) Superclonal™二抗检测Alexa Fluor™488(绿色,货号 A27034)，使用ProLong™Diamond Antifade Mountant染色细胞核，以检测抗GLS抗体。用DAPI(蓝色,货号P36962)和细胞骨架F-肌动蛋白用Invitrogen™罗丹明鬼 笔环肽(货号R415)标记。 （B） 使用各种细胞系的富集膜的提取物进行GLUD的蛋白质印迹分析。用Invitrogen™GLUD多克隆抗体(1:2,000稀释，货号PA5-29492) 探测印迹， 并使用Invitrogen™山羊抗兔IgG(H + L)二级抗体HRP（0.25 µg / mL,1:4,000稀释度；货号A27036）。观察到对应于GLUD的55kDa条带。 （C）使用siRNA介导的GLUD敲低通过蛋白质印迹分析确定该GLUD抗体的特异性 |
除上述用于葡萄糖代谢的抗体外，Thermo Fisher Scientific还提供了广泛的针对各种TCA循环中间体以及脂质和脂肪酸代谢的经过应用测试的特异性抗体。
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