诺扬生物

海星：Nature|类器官与基因编辑技术助力探究无脑回畸形的mTOR信号通路失调

诺扬生物

2025-07-23

无脑回畸形（lissencephaly）是一类罕见的大脑皮层发育障碍，特征为大脑沟回缺失或简化（光滑脑），临床表现为严重癫痫和智力障碍。尽管已知多种基因突变（如LIS1、DCX）可致病，但约40%患者病因不明，且分子机制长期未阐明。传统动物模型难以完全模拟人脑发育，而患者脑组织样本获取极其有限，阻碍了研究进展。英国耶鲁大学和土耳其伊斯坦布尔阿西巴德大学的研究团队发表在《Nature》的文章通过分析PIDD1突变和Miller-Dieker综合征（MDLS）患者的脑类器官，提出mTOR信号通路可能是两种遗传缺陷的“汇聚点”，还证实了脑特异性mTOR激活剂可逆转疾病表型，为临床干预带来希望。

1. PIDD1基因突变是新型致病因素

为了探究罕见无脑回畸形的遗传病因，研究团队对耶鲁大学神经遗传学队列中3个无血缘关系的近亲家庭（NG8、NG375、NG1801）进行全外显子测序（WES），分析患者的基因突变情况，并结合脑部影像确认表型。

结论

患者MRI显示典型弥漫性巨脑回（pachygyria）；

发现PIDD1基因的隐性突变（无义突变W589X、R331X或剪接位点突变c.2042-2A>G）与无脑回畸形相关。这些突变导致PIDD1蛋白的C端片段（含死亡结构域）缺失，破坏了CASP2-PIDDosome复合物的形成，进而影响神经发生过程。

关键意义：PIDD1作为凋亡调节因子，首次被证实参与人类皮层发育。

拓展数据图1. PIDD1的纯合突变与无脑谱系障碍有关

2. PIDD1突变类器官的祖细胞缺陷

为了解析PIDD1突变对神经祖细胞增殖、分化和分裂的影响，研究团队将携带R331X突变的患者毛囊角质细胞重编程为iPSC，通过CRISPR-Cas9技术构建同源修复细胞系（rescue）和突变敲入细胞系（knock-in），诱导形成大脑类器官。在第50天（D50）和第70天（D70）通过免疫荧光染色检测神经祖细胞标志物（如HOPX、SOX2、TBR2）和凋亡标志物（CC3），分析细胞数量、分裂方式及神经发生状态。

结论

PIDD1突变类器官中，室管膜下区（SVZ）的HOPX+外放射状胶质细胞（oRG）数量减少40%，祖细胞不对称分裂增加，神经发生提前，导致神经元过度生成。这一缺陷与细胞增殖或死亡无关，而是祖细胞分化状态异常所致。

图1. PIDD1突变类器官中神经前体细胞失调

3. PIDD1突变类器官的皮质板异常

为了验证PIDD1突变是否重现无脑回畸形的典型病理特征（皮质增厚、层状结构紊乱），研究团队对D50、D70和D120的类器官进行免疫染色，检测深层（CTIP2+）和上层（SATB2+）神经元的分布，量化皮质板（CP）厚度及神经元密度。通过Golgi-Cox染色观察神经元形态。

结论

PIDD1突变类器官的CP显著增厚2倍，且SATB2+和CTIP2+神经元的共定位比例增加，提示神经元分化缺陷。至D120，SATB2+细胞分布广泛且密度升高，CP异常扩张持续存在，但神经元形态无明显异常。这与人类无脑回畸形的皮质增厚表型一致。

图2. PIDD1突变类器官中的CP缺陷

4. 单细胞测序揭示转录组失调

为了检查转录扰动和相关的细胞状态，研究团队对D70类器官进行单细胞RNA测序（scRNA-seq），分析放射状胶质（RG）、oRG、IPC差异基因。

结论

神经发生通路下调：神经元分化相关基因（NEUROD2/BCL11B）表达降低；

翻译-代谢通路上调：核糖体生物合成（GO:0042254）和氧化磷酸化通路激活；

mTOR信号基因紊乱：RPS6/RHEB等表达与PIDD1显著负相关。

矛盾现象：翻译相关基因转录上调，但蛋白质合成实际下降（见下文蛋白质组）。

图3. scRNA-seq揭示了PIDD1突变类器官中的转录调控异常

5. 蛋白质组锁定mTORC1低活性

为了评估蛋白质水平的变化，研究团队对D70类器官进行了高分辨率液相色谱-串联质谱 (LC-MS/MS) 分析并做GSEA通路富集。

结论

PIDD1突变与MDLS类器官均显示：mTORC1信号抑制和蛋白质翻译水平降低，pS6（mTORC1活性标志）在SVZ区减少60%，提示两种遗传病因通过不同路径汇聚于mTORC1低活性这一共同节点。

图4. MS分析揭示了PIDD1突变和MDLS类器官中的蛋白质通路失调

6. mTOR信号通路的低活性

接下来，研究团队寻找了mTOR信号减少的证据，以显示PIDD1突变体类器官和MDLS类器官中的mTOR信号减少。通过免疫荧光检测磷酸化核糖体蛋白S6（pS6，mTORC1活性标志物）的表达，结合WB分析磷酸化AKT（pAKT）和pS6的蛋白水平，比较对照组、患者、敲入、修复及MDLS类器官的差异。

结论

PIDD1突变和MDLS类器官的SVZ中，pS6⁺SOX2⁺细胞数量及pS6信号强度显著降低，pAKT和pS6蛋白水平也下降，证实mTOR信号通路活性不足是两种疾病的共同特征。

图5. PIDD1突变体类器官和MDLS类器官中的mTOR信号减弱

7. mTORC1激活剂的治疗潜力

已证明抑制mTOR通路过度活跃的药物对多种临床适应症有效，研究团队用脑特异性mTORC1激活剂NV-5138（50 μM）处理类器官，分别从D30（预防）或D50（逆转）开始给药，至D70或D120检测pS6信号、CP厚度及神经元分布。通过scRNA-seq分析药物对转录组的影响。

结论

NV-5138可显著增强mTORC1活性（pS6信号升高1.8倍），预防并逆转PIDD1突变和MDLS类器官的CP增厚，恢复神经元的正常分布。此外，药物可增加2倍oRG细胞数量，改善祖细胞缺陷。

图6.一种mTORC1激活剂拯救了PIDD1突变体类器官和MDLS类器官中mTOR通路的低活性和CP增厚

本研究通过两大创新模型突破瓶颈：

患者iPS细胞来源的脑类器官：模拟孕早期人脑皮层发育

CRISPR构建同基因对照：消除个体遗传背景干扰

首次证实mTOR通路低活性是两种遗传背景不同的无脑回畸形的共同机制，突破了以往对mTOR opathies多与通路过度激活相关的认知。脑特异性mTORC1激活剂NV-5138的干预效果为临床治疗提供了全新方向，未来需在动物模型中验证其安全性和长期疗效。此外，mTOR通路可能作为皮质折叠异常疾病的“隐藏枢纽”，为其他相关疾病的研究提供参考。