蛋白MARKER知多少？
做WB的小伙伴都会用到蛋白Marker。关于蛋白Marker，小编经常接到技术咨询电话如何选择蛋白Marker，蛋白Marker条带不准，Marker条带消失、弥散，Marker条带能不能曝光出来……等问题。今天小编就带大家从以下几个方面来详细了解一下蛋白Marker。
蛋白Marker：即蛋白分子量标准，是一些已知分子量的蛋白质的混合物，像“尺子”一样用来指示蛋白质条带的大小。
目前最常用的蛋白Marker分为非预染蛋白Marker、预染蛋白Marker。
非预染蛋白Marker
是几种已知分子量并纯化好的蛋白质预混液。非预染Marker在电泳过程中看不到，电泳结束后经过蛋白染色后才能起指示作用，无法在实验过程中起预示作用。但是由于蛋白没有附带染料分子或者是标记分子，所示大小正好是蛋白原本的大小，所以最准确。
预染蛋白Marker
是纯化好的几种蛋白，通过与染料共价耦联后混合在一起，在电泳过程中或者转膜时可以直接观察到的一种蛋白Marker。
预染蛋白Marker在电泳过程可以起到预示作用，当观察目标蛋白大小位置进入最佳分辨区时，停止电泳，以得到最佳分辨效果。转膜过程可以监测转膜效率，同时可以在膜上标记蛋白分子量。
但是蛋白分子标记了染料后，由于染料标记效率存在一定的波动，所以各个批次间蛋白 Marker大小可能会存在一定的偏移，也就是预染蛋白Marker条带代表的是相对大小，而不是绝对大小。
预染蛋白Marker，又分单色预染Marker、双色预染Marker，多色预染Marker。如图：
单色预染蛋白Marker通常会加深某些条带的粗细，方便我们快速记忆和区分各个条带的大小。而彩色蛋白Marker则用不同的颜色，更加方便记忆区分。
除了上面介绍的，市面上还有一些其他类型的蛋白Marker：如显影蛋白Marker等。
显影蛋白Marker，蛋白条带中含有lgG结合位点，lgG结合位点会结合用于检测靶蛋白的一抗或二抗，使得蛋白Marker在印迹膜上可与目的条带一同呈现。
首先明确自己实验目的，如果只需要电泳后观察蛋白条带大小，可以用非预染蛋白Marker，毕竟价格便宜，且条带大小准确。如果做WB实验，可以选择预染蛋白Marker，这样可以实时观察到电泳、转膜情况。
预染蛋白Marker的选择，我们主要可以从以下几个方面考虑。
分子量范围：
蛋白Marker又分为高分子量、低分子量、宽分子量几类。检测大分子量蛋白经常使用到高分子量范围Marker，检测小蛋白甚至是一些多肽常会用到小分子量范围Marker。如果从整个实验室考虑，选宽分子量、条带分布比较均匀的Marker，这样你的蛋白无论在哪个区间都容易判断。
条带准确性：
可以用非预染蛋白Marker作为参考、校准。
稳定性：
偶联的染料是否容易脱落，使条带颜色变浅，Marker是否容易降解。
与膜的亲和性：
转到膜上因为要多次洗膜，长时间孵育，所以Marker蛋白与膜的亲和性也十分
重要。
常见问题：
预染蛋白Marker，染料的标记反应和蛋白质的其它标记反应一样，其实际标记效率由于各种各样的因素而波动于一个合理的区间，不是一个确定的常数。在预染蛋白Marker的生产过程中，染料标记效率的波动将直接影响到最终标记产物的分子量大小。因此厂商都有一套优化的条件来实现相对稳定的染料标记效率。即使如此，标记效率的稳定性仍然不可能达到一个稳定的常数，仅能将其控制在一个比较小的波动范围。其结果是，染料标记的蛋白质产物的分子量在不同批次间会存在一定的波动。这就是我们俗称的分子量准不准的问题。由上述原理可知，没有哪家公司的预染蛋白Marker具有绝对的准确性。正如Thermo在其产品说明书中明确写道，预染蛋白Marker仅用作为蛋白质分子量的近似参考，不同批次产品间具有不大于5%的批间差异。
不同的蛋白质（不考虑修饰） ，即使分子量相同，也有可能（比例较小）由于氨基酸组成的不同等因素，而表现出泳动迁移率的差异。实践中，这种看起来似乎不符合电泳原理情况常常会出现，相信做实验比较多的小伙伴可能也曾遇到过。
同一蛋白Marker产品的谱型在不同体系的电泳中，也会出现不同的泳动行为。例如下图。
此外，相比于预制的梯度凝胶，在自制的固定浓度凝胶中，预染蛋白质分子量标准的条带会看起来显得略粗一些，而不如前者锐利。当条带较粗的时候，我们的实践经验显示，分子量的参考一般应以条带的上半部为准。
有些小伙伴的WB结果参照蛋白Marker，与预期大小不符，第一反应就是Marker不准。那么除了我们上面分析的预染蛋白Marker本身的准确性的问题，还有没有其他原因呢？
SDS-PAGE凝胶电泳按照分子量大小将蛋白分离，是蛋白在充分变性、还原条件下，使蛋白分子带上均匀密度负电荷，蛋白分子的形状是短轴一样的链状结构（单条肽链）来实现的。如果蛋白样品未充分变性、还原，其形状和电荷等因素会影响迁移率从而导致分子量与预期不符合。下图（1为变性、还原BSA（66KD）；2为变性、非还原BSA）。
由于基因表达的差异性，同种蛋白在不同来源样品中分子量可能略有差异。下图：来源CST（使用 GAPDH (D4C6R) Mouse mAb 对不同细胞系提取物进行蛋白质印迹分析。）
另外蛋白样本出现部分降解也可能会出现条带变小。由于蛋白序列的差异，降解的原因的不同，所以即使同一管样品，不同的蛋白可能降解程度不同。
除此之外，最近有客户做Ip实验遇到重链、轻链问题。反馈说跑出来的轻链条带位置，在雅酶Marker的25kd以下，认为雅酶Marker条带不准。客户普遍认为轻链是25kd，实际上轻链在22-23kd范围，下图（merck官网）。
大条带消失：
Marker条带跑不出或者大条带消失原因一种是Marker本身降解，一种是电泳过程中降解。如果本身降解，电泳一开始应该就是模糊或者条带缺失的。如果是电泳过程中降解，是刚开始有，跑着跑着大条带消失。电泳过程降解，多是因为外槽电泳液加的非常满，和内槽液直接连通，导致短路，或者电极老化短路导致。
小条带弥散或者消失：
可能是电泳液中不含SDS或者SDS含量低于正常用量。
蛋白Marker每一个条带是单一纯化的蛋白，相对于目的蛋白其在膜上含量很高，所以如果抗体浓度以及抗体孵育的时间不合适，容易发生Marker蛋白和抗体非特异性结合，从而爆出条带。可以降低抗体浓度或者减少孵育时间，以及减少Marker上样量来优化。
雅酶多色预染蛋白分子量标准
| 货 号 | 产品名称 | 规 格 | 产品价格 |
|---|---|---|---|
| WJ101 | 双色预染蛋白Marker 15kDa~150kDa | 250μL×2 | 398元 |
| WJ101L | 双色预染蛋白Marker 15kDa~150kDa | 250μL×10 | 1488元 |
| WJ102 | 双色预染蛋白Marker 10kDa~250kDa | 250μL×2 | 448元 |
| WJ102L | 双色预染蛋白Marker 10kDa~250kDa | 250μL×10 | 1688元 |
| WJ103 | 三色预染蛋白Marker 10kDa~250kDa | 250μL×2 | 448元 |
| WJ103L | 三色预染蛋白Marker 10kDa~250kDa | 250μL×10 | 1688元 |
| WJ106 | 双色预染蛋白Marker 10kDa~250kDa 适用于近红外荧光成像系统 | 250μL×2 | 448元 |
| WJ106L | 双色预染蛋白Marker 10kDa~250kDa 适用于近红外荧光成像系统 | 250μL×10 | 1688元 |
| WJ201 | 非预染蛋白Marker（10kDa~235kDa） | 250μL×2 | 158元 |
注：WJ106 系列适用于近红外荧光成像系统。
g 高准确性 —— 蛋白条带分子量相较于同级别其它高端品牌产品更准确；
g 分布合理 —— 蛋白条带分布更合理；
g 低杂交反应 —— 条带蛋白去除蛋白质标签，最大程度降低抗体杂交反应；
g 高性价比 —— 与其它同级别产品相比，性价比极高。
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