细胞凋亡(Apoptosis)是最常见的细胞死亡方式之一，其受到基因的严格调控。

细胞凋亡过程常伴随着明显的细胞形态学变化，比如细胞凋亡早期，质膜内侧的磷脂酰丝氨酸(phosphotidylserine，PS)会翻转到细胞质膜表面；而在凋亡的中后期，随着细胞质膜通透性的增大，一些较大分子的化合物，如碘化丙啶(Propidium Iodide，PI，一种DNA结合染料)，便可自由扩散进入细胞，将细胞核染上红色荧光。

Annexin V(膜联蛋白-V)是一种分子量为35~36kDa的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与磷脂酰丝氨酸高亲和力特异性结合。以Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒为例，其对细胞群进行染色后，早期凋亡细胞显示绿色荧光，晚期凋亡细胞及坏死细胞显示红色和绿色荧光，活细胞则几乎没有荧光。

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图一 Annexin V-FITC/PI凋亡检测原理示意图

实验流程

了解完Annexin V细胞凋亡检测原理后，下面就让我们一起来看一下具体的实验流程吧！

图二 Annexin V实验流程图

PART ➀ 实验方案设置

要想实验成功，肯定要做好实验前准备工作，首先设置好实验方案，具体如下(以流式细胞仪检测为例)：

1. 空白管：仅用结合缓冲液重悬的细胞，以评估自身荧光水平，并相应地调整仪器；

2. 单染管：分别用荧光标记的Annexin V或碘化丙啶(PI)染色，以确定每个细胞群体的边界，作为单染组用于调节补偿；

3. 阴性管：细胞无任何处理，加入荧光标记的Annexin V和碘化丙啶(PI)染色，目的是用于确定正常细胞状态，排除假阳性；

4. 阳性管：确定发生凋亡处理的细胞，加入荧光标记的Annexin V和碘化丙啶(PI)染色，用于确认操作、试剂和仪器都没有问题；

5. 实验管：实验细胞加入荧光标记的Annexin V和碘化丙啶(PI)染色，用空白管和单染管调整好仪器后，获得结果数据。

PART ②   消化贴壁细胞

对于贴壁细胞，先用适量胰酶(不含EDTA)消化细胞，而悬浮细胞可省去此操作。

请注意：

1. 由于EDTA是Ca2+螯合剂，EDTA会络合Ca2+，从而影响Annexin V与PS的结合，若使用含EDTA的胰酶有可能会造成假阴性，所以建议用不含EDTA的胰酶消化贴壁细胞。

2. 如需使用含EDTA的胰酶消化细胞，有必要在染色之前用PBS或结合缓冲液洗涤细胞多次以去除EDTA，从而避免螯合Annexin V所必需的Ca2+。
   

3. 消化细胞的时间不能太久，处理细胞时要轻柔，若过度消化或机械损伤细胞都会导致细胞膜受损，从而造成假阳性。

4. 消化下来的细胞，建议在培养箱中孵育一段时间，以恢复细胞膜完整性；
   

5. 检测前细胞密度为80%-90%即可，细胞过密会导致细胞出现大量凋亡，增加了凋亡细胞的比例；

6. 培养基中也存在已经悬浮的发生凋亡或坏死的细胞，因此也收集下来进行检测。

PART ③   重悬细胞

无论是悬浮细胞还是贴壁细胞(消化后)进行细胞重悬，轻柔吹打洗涤，并离心收集细胞，制备细胞悬液使细胞浓度达到1×106cells/mL。

请注意： 实验操作需尽量轻柔，最大限度地保留凋亡的细胞。

PART ④   细胞染色

取细胞悬液(细胞总数为1×105cells)加入荧光标记的Annexin V和碘化丙啶 (PI)轻轻混匀，室温避光孵育10~15min。

请注意:

01   试剂盒试剂在开盖前请短暂离心，将管盖及内壁上的液体甩至管底，以避免开盖时液体洒落；

02   荧光标记的Annexin V和碘化丙啶(PI)是光敏物质，在操作时请注意避光；

03   碘化丙啶(PI)有毒，能透过皮肤进入体内，使用时请做好防护；

04   若一次检测很多样本，加入碘化丙啶(PI)的时间间隔一般为30~60sec；

05   建议细胞在染色后1h之内完成检测。

PART ⑤   上机检测

染色孵育后，立即进行流式细胞仪检测或荧光显微镜检测。

请注意:

流式细胞仪检测时，以Annexin V-FITC为例，可使用FITC通道(通常是FL1)检测Annexin V-FITC，phycoerythrin通道(通常是FL2)检测PI。用CellQuest等软件进行分析，以FITC为横坐标，PI为纵坐标，绘制双色散点图(two-color dot plot)。

流式结果图

凋亡实验中主要分析细胞凋亡早期，但是具体还要参照我们的实验目的，三个重复后进行统计分析。

流式凋亡结果中各个象限代表如下：

左上象限(Annexin V-/PI+)：

左上象限为细胞碎片、机械损伤细胞或其它死细胞；Annexin V-/PI+象限中细胞数越多，实验结果可信度就越低，因尽量控制本象限细胞比例。

左下象限(Annexin V-/PI-)：

左下象限为正常的活细胞；

右上象限(Annexin V+/PI+)：

右上象限为晚期凋亡细胞或坏死细胞，细胞膜损伤的细胞DNA可被PI着染产生红色荧光；

右下象限(Annexin V+/PI-)：

右下象限为早期凋亡细胞，在细胞凋亡的早期PI无法着染，不会产生红色荧光信号。

图三 流式细胞仪凋亡检测结果图

常见问题解析

1.对照组比处理组凋亡比例高：

a.细胞培养状态不理想；

b.收集细胞后，没有及时染色；

c.过分吹打、震荡，导致细胞膜受损，PS暴露出来。

2.处理组比对照组凋亡比例低：

a.对细胞凋亡诱导刺激强度不足；

b.过度增殖的细胞对凋亡诱导不敏感；

c.贴壁细胞消化时间过长，导致膜表面的PS受损，Annexin V结合位点减少。

其实我们只要在实验过程中严格遵守每一条实验注意事项，获得实验的成功就一点也不难。

结果验证

实验对象：Sp2/0细胞；

实验组：加入10 nM的紫杉醇过夜诱导凋亡；

对照组：未处理。

CX005

Annexin V-EGFP/PI凋亡检测试剂盒

荧光检测结果

CX006

Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒

荧光检测结果

CX006

Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒

流式细胞仪检测结果

产品信息

注：与FITC相比，EGFP的绿色荧光信号具有信号强，不易淬灭，稳定性高等优点。但因EGFP光谱范围与PI有部分重叠，所以如进行流式检测，建议使用CX006 Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒