海星：细胞支原体污染的检测与处理方法

诺扬生物
2025-03-04

一、细胞支原体污染的表现

支原体是一种原核生物，支原体是最小和最简单的自我复制生命体。由于支原体体积小（100nm），缺乏刚性的细胞壁，因此肉眼无法检测到支原体，它们可以透过0.2μm的标准过滤膜，并对很多抗生素都具有抵抗力，可以感染多种细胞类型，包括动物和人类细胞。细胞支原体污染在细胞培养、疫苗制备和基因表达等领域中非常常见，尤其是在细胞系的研究和生产过程中，其主要表现如下：

1. 细胞形态改变：细胞支原体感染后，细胞形态会发生改变，表现为细胞大小和形状的变异。

2. 细胞生长受限：细胞支原体感染会影响细胞的生长和增殖，导致细胞培养的增殖速度减慢或无法生长，从而影响实验的进行。

3. 细胞功能异常：细胞支原体感染还会导致细胞内代谢活性下降和功能紊乱，影响细胞信号传导和基因表达等生物学过程。

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二、细胞支原体的检测方法

目前实验室常用的支原体检测方法有PCR 法、培养法、荧光指示细胞法、扫描电子显微镜法，这些方法各有优缺点。各实验室可根据具体情况，选择不同的方法，或几种方法联合使用。


1. PCR 法

PCR是一种常用的分子生物学技术，可用于快速、特异、敏感地检测细胞支原体的存在。
海星生物根据《欧洲药典》要求检测的支原体种类自助研发设计，经过多重验证，使用的支原体特异性引物可对检测样品进行精准检测，实验添加阳性质控标准品及阴性对照组，准确判断样品是否存在支原体污染，为后续实验保驾护航。


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支原体PCR检测数据

PCR 法检测支原体的方法最为快速、灵敏、取样量少，既可做细胞本身，也可做细胞上清的检测，同时可以检测多种支原体的污染，是目前常用的检测手段。但其成本较高，条件要求严格，且有时易出现假阳性或假阴性。弥补的方法是对怀疑的样品要经过3 次PCR 检测，或用培养法检测。


PCR 检测方法

（一）材料与设备支原体

PCR 检测试剂盒、dNTP 、TaqDNA 聚合酶、缓冲溶液、琼脂糖、矿物油、超净工作台、PCR 仪、电泳仪、凝胶成像分析系统、台式离心机、旋涡混旋器等。

（二）操作步骤

（1）样品的收集。待测细胞用无双抗培养液培养7d，用无菌容器取上清液500μl ,4℃ 保存待测。
（2）模板的制作。在无菌的条件下， 取细胞培养上清1 00μl 于一无菌的0.5ml塑料离心管内，盖好盖子， 95 ℃ 水浴加热5min 。
（3）打开盖子，向管内加StrataClean Resin 10μl，盖好盖子，旋涡混悬器混合，离心5~ 10s, 吸取上清至一新的塑料离心管中，模板制作完毕， 4℃ 保存。
（4）PCR 反应。反应体系的最适条件为10mmol/L Tris-HCI (pH 8.38), 50 mmol/L KCI, 1.5~ 2.5 mmol/L MgCl2，200 μmol/L dNTP, 2U Taq DNA 聚合酶，总反应体系为50μl ， 反应用去离子水均需用紫外灯照射。
a. 在0.5ml 塑料离心管中加入35.2μl 去离子水及5μl 10 xTaq 反应缓冲溶液。
b. 依次加入下列成分：0.4μl dNTP (25mmol/L）、0.4μl Taq 酶(5U/μl ) 、2μl引物。
c. 加2μl 去离子水，总体积45μl 。
d. 加5μl 已制成的模板到反应体系中。
e. 阳性对照，内对照各5μl 加入到各自的反应体系中。
f. 取1支含有以上反应体系的离心管，加入5μl 去离子水作为阴性对照管。
g. 在反应体系中加入100μl 矿物油。
h. PCR 程序见下表。
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（5）琼脂糖凝胶电泳。PCR 反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶浓度为2%。电泳结束后，凝胶成像分析结果。6. 结果分析。该方法为检测支原体的定性方法，在电泳泳道上， Marker、阳性对照、内对照均会出现不同的电泳条带， 当被检样品泳道出现明亮条带，且位置在阳性对照和内对照条带位置之间，即可认为该样品被支原体污染 。
有时还会发现一条泳道出现多条，可能是该样品感染2 种以上支原体所致。如果泳道内条带隐约出现，则可怀疑有支原体污染，重做该样品。


（三）注意事项PCR 反应的前期操作应在无菌环境中进行。注意假阳性、假阴性，有时需多次重复。


2. 培养法

培养法为最为经济可靠的方法，但其实验周期较长，所以常用来进行对怀疑细胞的最后甄别。常用于细胞及临床治疗细胞的支原体检查。

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（一）材料与设备

1. 精氨酸肉汤培养基   按说明称量粉剂，蒸馏水配制， 高压除菌（加20％胎牛血清）。
2. 支原体琼脂培养基   按说明称量粉剂，蒸馏水配制，高压除菌（加20％胎牛血清）。
3. 其他   超净工作台、无菌吸管、试管架、培养试管／皿、37°C 培养箱。

（二）操作步骤

1. 样品的储存。样品取材后，最好尽快进行检测。样品如在24h 以内进行支原体检测， 可储存在2~8℃; 如果超过24h 样品应放置于－20℃ 以下保存。-20℃保存的样品，进行检测时需重新加入到对照培养细胞中，培养72h 后，取上清直接进行接种检测。
2. 准备精氨酸肉汤培养基、支原体琼脂培养基（半流体）。
3. 将样品分别接种到10ml 精氨酸肉汤培养基、半流体培养基中（已冷却至36℃） ，每支培养基接种样品0.5~ 1.0ml. 每种样品接种6 支精氨酸肉汤培养基，3 支半流体培养基。
4. 接种6d 后，取3 支精氨酸肉汤培养基中样品0.5 ~ 1.0ml. 复种于精氨酸肉汤培养基中。
5. 36 ℃ 培养29d, 每隔3d 观察一次。记录实验结果。

（三）结果判断

培养结束时，精氨酸肉汤培养基如有支原体生长，则液体颜色改变（粉色或黄色) 。
半流体培养基中如有支原体生长，则出现絮状沉淀

3. 荧光指示细胞法

荧光指示细胞法较为快捷，方法简单，但其灵敏度有一定的欠缺， 易造成漏检。

常见的支原体检测方法中最简单、最经济的方法是荧光指示细胞法。该方法使用的荧光染料是烟酸己可碱，其激发波长为350nm（紫外激发），发射波长为420nm。该染料会结合到DNA 中富含A-T 的区域，由于支原体的DNA中A-T 含量占多数(55%~80%），所以可被染色而检测到。支原体污染的细胞经染色后，在细胞核外与细胞周围可看到许多大小均一的荧光小点，即为支原体DNA, 证明该细胞有支原体污染。
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（一）材料与设备

1. 荧光显微镜
2. CO2 培养箱

3. 无菌小爬片

4. 无菌培养皿

5. 不含抗生素的完全培养液
6. 二苯甲酰胺荧光染料浓缩液(50μg/ml)。称取5mg 二苯甲酰胺荧光染料加入100ml 不含酚红和碳酸氢钠的Hanks 平衡盐溶液中，在室溫下用磁力搅拌30~40min, 使完全溶解，－20℃ 避光保存。
7. 二苯甲酰胺荧光染料工作液(0.5μg/ml) 。取1ml 上述浓缩液，加至100ml 无酚红和碳酸氢钠的Hanks 溶液中，终浓度为0.5μg/ml 。
8. 固定液，即乙酸：甲醇(1 : 3) 溶液为细胞固定液。
9. 封片液。0.1mol/L枸橼酸22.2ml, 0.2mol/L Na2HPO4·12H2O 27.8ml, 丙三醇50.0ml，以上三者混匀，调pH 至5.5 。
10.不含酚红和碳酸氢钠的Hanks 平衡盐溶液或PBS。经多种方法检测确定为支原体阴性的Vero细胞。


（二）操作步骤
1. 无菌收集待测细胞上清：悬浮细胞离心后取上清液。
2. Vero细胞爬片：将小爬片无菌置于小培养皿内，滴加Vero细胞悬液(细胞浓度约3×104 个/ml) 2~3ml, 置于CO2 培养箱内培养24h 使其贴壁。
3. 制备标本。向6 孔板内滴加待检细胞上清液约1ml, 注意设立对照组（已证实的支原体阳性和阴性细胞上清液），培养48h 后( VERO 细胞汇合前）将细胞爬片从平皿中取出。
4. 漂洗—将细胞爬片置于培养皿中，用不含酚红、NaHCO3 的Hanks 溶液（或PBS) 漂洗3次。
5. 固定—用乙酸：甲醇(1 : 3)固定液固定 10 min。
6. 漂洗—待固定液自然风干后用去离子水漂洗3次。
7. 染色—置于荧光染色液(0.5μg/ml)中染色10 min。
8. 漂洗—去离子水中漂洗3 次，每次1 ~2min。
9. 封片，紫外激发，观察。


（三）结果判断
当阴性及阳性对照结果均成立时，结果有效 。
1. 阴性结果 仅见待检细胞的细胞核呈现蓝色荧光。
2. 阳性结果 荧光显微镜下细胞周围或细胞膜表面可见大小不等、不规则的蓝色荧光小点和丝状点。

（四）小结
1. 严格配制工作液及封片液。

2. 保证作为指示细胞的Vero细胞没有被支原体污染。
3. 必须同时设立阳性及阴性对照， 注意重复，以排除假阳性和假阴性结果。4. 应全面观察爬片，并注意可疑阳性的荧光点是凋亡小体还是支原体污染。
5. 可适当调整荧光染料的工作浓度和染色时间，避免出现非特异性染色，如胞浆着色。


4. 扫描电子显微镜法

扫描电子显微镜法：扫描电子显微镜法非常直观、准确，对使用环境要求高，操作复杂，实验周期较长，常作为样品的最后定性检测。


（一）原理

利用电子显微镜的超级放大功能， 直接观察培养细胞中支原体污染情况。


（二）材料与设备

待检测细胞，0.05％胰蛋白酶／0.02%EDTA 、2.5％的戊二酸、1％锇酸、0.1mol/L磷酸缓冲溶液（ pH7.4 ) ，扫描电镜及相关设备。


（ 三）操作步骤

1. 将待检测细胞传代至贴有盖玻片的培养皿中。
2. 37°C , CO2培养箱中培养24h , 取出盖玻片。
3. 以PBS 洗涤3 次。
4 . 以2 .5％戊二醛/PBS 固定15min , PBS 洗涤。
5 ．以1％锇酸固定30min, PBS 洗涤。
6 . 乙酸异戊酯脱水。
7. CO2冰点干燥。
8. 喷金。
9 . 扫描电镜观察，照相。


（四）结果分析

三、细胞支原体污染的处理方法

1. 用支必清支原体清除处理：海星生物自主研发的HyCyte®支必清支原体清除可以有效清除支原体。经验证，可有效去除/防止莱氏无胆甾原体（Acholeplasma laidlawii）、精氨酸支原体（Mycoplasma arginini）、猪鼻支原体（Mycoplasma hyorhinis）和口腔支原体（Mycoplasma orale）等动物细胞培养中85%以上支原体菌株污染的。除此之外HyCyte®支必清支原体清除/预防试剂对培养细胞没有细胞毒性副作用。

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2. 用清洗纯化法清除支原体污染的方法：细胞营养驯化→优质细胞群的筛选→细胞清洗→反复离心洗涤，其原理是利用离心力、细胞、微生物质量和悬液的浮力差达到清除支原体的目的。由于支原体个体小且除发酵支原体外多为细胞外寄生,所以通过反复洗涤细胞和低速离心换液使其中潜在的支原体数量降低至极限. 如结合敏感抗生素的抑杀作用，可达到更好的效果。

3. 药物辅助加温处理：先用药物处理后，再将污染的组织培养物放在41℃培养18小时，可杀死支原体，但对细胞有不良影响。

4. 使用支原体特异性血清用5%的兔支原体免疫血清可去除支原体污染，因特异抗体可抑制支原体生长，故经抗血清处理后11天即转为阴性，并且5个月后仍为阴性。

5. 动物体内接种除菌法：把受支原体污染的肿瘤细胞接种在同种动物皮下或腹腔中，借动物免疫系统消灭支原体，而肿瘤细胞却能在体内继续生长，待一定时间后，从体内取出细胞再进行培养繁殖。

6. 巨噬细胞吞噬法：从动物腹腔采取巨噬细胞，为排除其它细胞成分，可先进行纯化，然后再加入被支原体污染的细胞培养液中混合培养。在培养过程中，为检查支原体是否已被消除干净，可利用支持物培养法验证，取出支持物逐日染色、镜检观察，至支原体已被消除干净为止。

7. 使用支原体清除培养基，每2~3天更换1次新鲜培养液，换液时用无菌的平衡盐溶液洗涤细胞1~2次；期间如果细胞密度过大，请保持细胞密度适当（贴壁细胞能需要用胰酶消化），并更换新的培养器皿，3天之后，即可见明显清除效果；处理15天后，可以用支原体检测试剂盒进行检测，检测支原体是否杀灭完全；如果仍有支原体残留，可以考虑再处理6天；为避免细胞再次受到“支原体”的污染，以后每隔1个月进行支原体的常规检测，以保证没有新的支原体污染。

注意事项

  • 避免交叉污染：支原体可通过气溶胶传播，处理时需关闭生物安全柜风机5分钟后再操作。

  • 定期进行支原体检测非常重要，一般来说每1至3个月就应该进行一次支原体检测。

  • 细胞复苏后检测：冻存细胞复苏后需重新检测，避免潜伏污染。

  • 避免过度依赖抗生素：长期使用可能诱导耐药性，建议优先选择丢弃污染细胞。


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