四正柏：细胞周期检测，从此只有捷报！
碘化丙啶（Propidium，简称PI）是一种双链DNA荧光染料。碘化丙啶和双链DNA结合后可以产生荧光，荧光强度和双链DNA的含量成正比。当细胞内的DNA被碘化丙啶染色后，可以用流式细胞仪对细胞进行DNA含量测定，根据DNA含量的分布情况进行细胞周期分析。
关于细胞周期检测的具体实验步骤，现有的操作流程各不相同，目前分歧较大的步骤为细胞固定时的重悬方式以及染色后是否洗涤样本。我们专门对此进行验证，为细胞周期实验提供更多思路。
一、细胞重悬方式对实验结果的影响
为保证染料能顺利进入细胞，不被活细胞主动泵出，我们需要对细胞进行固定或透化处理。细胞的固定通常选择乙醇，乙醇既是脱水固定剂，同时兼具透化作用。固定时为避免细胞聚集成团，采用将重悬细胞逐滴加入到95%乙醇中的方式，使乙醇终浓度为70%。
在重悬细胞时，目前有使用PBS或纯水重悬两种方法。选择纯水重悬是考虑PBS和乙醇可能会出现絮状物，而选择PBS重悬则考虑纯水会导致细胞吸水涨破，可能影响染色和检测结果。为此，我们对这两种重悬方式做了验证。我们将准备待测的Reh细胞（人急性非B非T淋巴细胞性白血病细胞）分成2份，分别使用PBS和纯化水重悬细胞，然后各自对应逐滴加入到相同配制的95%乙醇中，两组后续的固定条件和染色处理均相同。
实验结果分析
两种重悬方式检测的相同点：
从检测结果来看，两种重悬方式对细胞周期的检测结果没有影响，两种重悬方式均能正确区分G1期、S期、G2期等，周期曲线拟合结果相近，实验结果一致。
两种重悬方式检测的不同点：
1、PBS重悬会产生絮状物
在实验过程中，PBS重悬的细胞悬液在逐滴加入乙醇溶液中后会产生少量絮状物，自细胞悬液加入乙醇溶液中直到过夜固定后都存在这种絮状物。但是固定后经离心收集再次重悬时絮状物消失，对周期检测实验结果无影响。（如图，左为PBS重悬，右为纯水重悬）
2、纯水重悬导致细胞数量减少
纯水重悬固定后，细胞数量远远低于固定前，而PBS重悬固定后细胞数量只有轻微的减少。经细胞计数统计，PBS重悬后细胞的回收率达到71.3%，而纯水重悬后回收率只有16.7%，这可能与细胞吸水涨破有关。
3、纯水重悬影响分群
从纯水重悬组的检测结果中，我们发现在同样的仪器设置条件下，纯水重悬后细胞群分开效果差，细胞碎片较多，表明纯水重悬可能会导致细胞吸水膨胀甚至涨破，改变细胞的形态大小及散射特性，导致细胞分群改变，不利于实验结果分析。
PI染色检测细胞周期时，纯水或PBS重悬的固定方式均可采用。PBS重悬固定会出现少许絮状，但后续絮状物会溶解，不会影响整体的实验结果分析。纯水重悬可能会引起细胞涨破，导致细胞碎片增加，检测的目的细胞数量大大降低。如果选择纯水重悬的方法，建议准备大量的细胞，同时考虑细胞状态以及检测仪器的分辨率，否则可能影响圈门分群，对操作者的流式经验要求比较高。
二：染色后是否洗涤对实验结果的影响
PI染色后，可以选择使用PBS对实验细胞进行洗涤。考虑到PI染料具有较强的粘性，不洗涤可能会导致荧光素残留，影响后续样本检测，甚至可能对最近一段时间同种荧光素的其他样本检测产生影响；此外荧光素的残留还可能造成流式细胞仪器管路堵塞。而PBS洗涤又可能会导致染料荧光强度降低，不利于实验结果分析。
对此，我们也进行了验证，分别在PI染色后采用洗涤和不洗涤两种方式检测细胞周期。结果表明，洗涤后荧光强度确实会下降，荧光强度低于不洗涤组，但在收集正常数量细胞时，实验结果的分析不会受到影响。所以，只要细胞数量正常，建议PI染色后对样本进行洗涤，避免PI粘性影响其他样本的检测，同时保证流式细胞仪的正常运行。
四正柏凭借20余年的技术积累，持续为客户提供优质的流式抗体服务。可提供基于PI、7-AAD两种DNA染料的细胞周期检测试剂盒，为科研工作者提供简单、方便、结果稳定可靠的高性价比细胞周期检测方案。