海星：CRISPR文库筛选主要应用场景介绍II
筛选病毒感染相关的宿主因子
研究背景
甲型流感病毒 （IAV） 从人畜共患宿主中出现，对人类健康构成巨大威胁。由于季节性疫苗对人畜共患菌株无效，并且新传播的病毒可迅速获得耐药性，因此仍然需要针对 IAV 的宿主导向疗法。在这里，我们使用禽 H5N1 菌株的人分离物在人肺上皮细胞中进行了基因组规模的 CRISPR/Cas9 敲除筛选。
研究思路
在 A549 细胞中生成了一个 GeCKO 文库，并进行全基因组筛选
步骤 1-4：用含有 sgRNA 文库 A 的慢病毒转导表达 Cas9 的 A549 （Cas9-A549） 细胞，并在嘌呤霉素中选择 14 天以生成 A549-GeCKO 文库。
首先，通过用表达 Cas9 基因的慢病毒转导野生型 （WT） A549 细胞，衍生出表达 Cas9 的克隆型 A549 细胞系 （Cas9-A549s）。接下来，用慢病毒转导 Cas9-A549，该慢病毒含有 65,383 个 sgRNA 的合并人类全基因组 sgRNA 文库，嘌呤霉素中选择 14 天
第5-7步：用低致病性H5N1病毒（VN04Low）感染A549-GeCKO库以获得耐药细胞。
第8a-9步：初步连续筛选：存活的细胞总共接受五轮H5N1感染，且耐药细胞的扩增量最小。在多达五轮的重复样本中评估了sgRNA在每轮感染中的代表性。
第8b-9步：顺序筛选：存活的细胞总共接受五轮H5N1感染，每轮之间耐药细胞的扩增量较大。
第10步：验证并鉴定选定的阳性克隆。
Rd2 和 Rd5 sgRNA 的序列测序分析。Rd2 和 Rd5 之间多个 sgRNA 代表的基因数量的减少表明，严格的 H5N1 选择导致单个 sgRNA 的优先富集。
为了进一步评估在 Rd5 处鉴定的基因，将测序对应gRNA的基因与先前报道的 9 个流感病毒全基因组筛选中鉴定的因子 进行比对分析. 液泡 ATP 酶家族成员在之前的 6 个筛选中被多次验证筛选出来，（ATP6AP1、ATP6AP2、ATP6V0A1、ATP6V0B、ATP6V0C、ATP6V1B2、ATP6V1G1 和 ATP6V1H 中也高度富集).此外，我们鉴定了 >400 个独特基因，证明 GeCKO 筛选可以揭示以前未识别的 IAV 宿主因子。
信号通路、抗体靶标等筛选
研究背景
研究方案
作者生成了 5 种表达 Cas9 的人 CD19+ B 细胞系，包括 3 种 BCP-ALL （Reh、NALM6 和 697） 和2 种来自慢性淋巴细胞白血病 （CLL， HG3） 和 B 细胞淋巴瘤 （TMD8） 的成熟 B 细胞肿瘤细胞系
作者生成了 5 种表达 Cas9 的人 CD19+ B 细胞系，包括 3 种 BCP-ALL （Reh、NALM6 和 697） 和2 种来自慢性淋巴细胞白血病 （CLL， HG3） 和 B 细胞淋巴瘤 （TMD8） 的成熟 B 细胞肿瘤细胞系
使用全基因组敲除文库对3个不同的BCP-ALL细胞系Reh、697和NALM6进行筛选，结合流式细胞术分选出CD19高表达和低表达的两个细胞类群，并进行NGS测序分析后，发现NUDT21基因的sgRNA,在这三个细胞高表达CD19的细胞群中均被显著富集，说明NUDT21基因的表达会下调CD19的表达。在确认B-AL中NUDT21高表达后，研究团队使用CRISPR/Cas9系统构建了该基因敲除的CD19+ B细胞系，发现NUDT21基因会直接抑制CD19 mRNA的稳定性及其蛋白表达
由于 NUDT21 是我们的全基因组 CRISPR 筛选中排名靠前的 CD19 表达抑制因子之一，并且在确认B-AL中NUDT21高表达后，后续研究团队，研究了 NUDT21 是否限制了转化的 B 细胞祖细胞中 CD19 表达的丰度，研究团队使用CRISPR/Cas9系统构建了该基因敲除的B-AL细胞系，发现NUDT21基因会直接抑制CD19 mRNA的稳定性及其蛋白表达
类器官中进行CRISPR-Cas9联合筛选
研究背景
为了促进肿瘤驱动因子的高通量基因检测和功能鉴定，开发了一个在人类结肠类器官中进行CRISPR-Cas9联合筛选的平台。
研究方案
在本文实验APC 缺失以及KRASG12D突变的癌前类器官中，筛选了泛癌肿瘤抑制基因（TSG）文库，并将其异种移植，以研究其在复杂肿瘤微环境下的克隆优势。
总之，这些发现突出了一个强大的基于类器官的平台，用于汇集CRISPR-Cas9筛选患者特异性功能基因组学。
研究思路
通过药筛系统将携带 Cas9 蛋白的慢病毒载体转入结肠类器官,建立了稳定表达 Cas9 的人结肠类器官培养体系。正常人结肠类器官对转化生长因子-β (TGF-β) 敏感，在培养体系中添加 TGF-β 可以有效杀死类器官，而敲除 TGF-B 的受体基因 (TGFBR) ，即用针对 TGFBR2 的慢病毒 gRNA 转导则可以挽救 TGF-β 导致的细胞毒性。
结果：在没有选择的情况下，4.0% 的细胞是报告基因阳性，但在 TGF-β 选择后，我们发现 68.0% 的细胞的报告基因表达强烈增加（图 1C）。观察到仅具有一种颜色的细胞的明显富集，仅适度偏向于双重整合（图 1C）。通过荧光显微镜检查，大多数类器官显示单一颜色，表明它们的克隆起源（图 1D），并证明 MOI < 1 的转导允许有效的 CRISPR-Cas9 修饰。
作者设计了针对 TGF-β 通路的 6 个关键组分 (图 3 A) 和 94 个对照基因。每个基因都被 20 个独立的 gRNA 靶向，整个文库包含 2,200 个 gRNA，并被转导到稳定表达 Cas9 的正常人结肠类器官中 (图 3 B)。以混合方式提取基因组DNA，并通过 NGS 分析慢病毒条形码。针对 TGFBR1 和 TGFBR2 的单个 gRNA 富集程度最高，证实了筛选系统的有效。
为了进一步研究类器官中的 gRNA 特性，我们将文库性能与永生化细胞系并排比较。HepG2 细胞中的活性通常与类器官的功能无关。所以选用该细胞作为比较进行。
全局比较表明，在类器官中效率高的 gRNA 通常在 HepG2 细胞中表现良好（图 2E、3D 和 3E）。
然而，对 HepG2 细胞中活性最高的 10 个 TGFBR1/2 gRNA 的限制使有效 gRNA 的分数从 15% 增加到 40%（图 3F）。我们得出结论，在异源细胞中进行预筛选可以获得更小、更有效的 gRNA 文库，从而提高类器官的性能。
接着，作者对异种移植类器官中的肿瘤抑制功能进行体内筛选。作者构建了一种预致瘤类器官系，AK 类器官 (APC-KO/KRASGG12D)，即缺失 APC 和致癌 KRASG12D 等位基因的结肠类器官。其仅在敲除 TGFBR2 (AKT 类器官) 后才显示出生长。
肿瘤抑制功能可移植类器官模型的开发[2]
