小伙伴们，之前给大家分享过雅酶新品膨胀胶，它所展示的超高分辨率，无疑使细胞免疫荧光实验如虎添翼！
不过在这段时间的交流中，小诺发现有些小伙伴对膨胀显微的操作流程不甚明晰，甚至还存在某些误区，从而导致实验结果不尽人意。
今天咱们就针对这些问题专门推出一期干货讲解，希望能对大家有所帮助！
首先，您要拥有一台性能优良的倒置荧光显微镜，一定要确保显微镜激发光是给力哒。
那如何判断显微镜性能行不行呢？最简单的，常用的DAPI染色的样本，在最大荧光强度下，用肉眼观察目镜，应该会感觉比较刺眼，这一般就符合要求。
雅酶膨胀显微试剂盒不适合活细胞成像实验，只能用于固定后的细胞。
本产品针对细胞爬片设计，不能用于组织样本，组织膨胀显微试剂盒正在加紧研发中。
这款试剂盒不能直接用于具有细胞壁的细胞，需消化细胞壁后得到原生质体，方可使用膨胀技术。
至于抗体，当然要选择效价高特异性强的！打个小广告，强烈推荐使用雅酶精品抗体，全都经过多次验证，用起来更放心。
PS：可以到传送门回看一下雅酶膨胀胶验证结果图，其中线粒体染色指标一抗Hsp60就是用的咱们雅酶精品抗体！
绿色玻璃片和玻底培养皿千万不要使用一次后就丢弃，可以洗干净重复使用。
玻底培养皿更适合在油镜下观察或拍照，如果使用空气镜，其成像效果可能会不理想，可将膨胀后的凝胶置于载玻片上，添加少量双蒸水，进行观察或拍照。
如果样本是悬浮细胞，需要先把细胞固定到细胞爬片上。
首先要确保细胞数目达到免疫荧光要求的细胞数。
然后吸取10μL的悬浮细胞至爬片上，加入10μL固定液等量混匀。
混匀后，放入烘箱37℃过夜烘干。
再使用PBS润洗，即可得到固定在爬片上的悬浮细胞！
PS：烘干后的样本不建议湿润保存，因为可能会有细胞脱落的风险！
后续可按免疫荧光步骤操作，再进行显微膨胀。
染色的荧光强度与空间大小成反比，膨胀后的样本体积增大，荧光强度随之下降。因此，为了让实验照片更加清晰，咱们要尽量提高样本的荧光染色强度。
最简单的方法是提高荧光二抗的使用浓度。例如，原本1:1,000使用荧光⼆抗，此时可以提高至1:100~200。如果提高荧光二抗浓度后结果仍不理想，也可以适当提高一抗浓度。
在膨胀前，先要在荧光显微镜下确认荧光强度符合预期，再进行后续膨胀操作。
灌胶时，可以先在爬片两侧各滴加10μL双蒸水，将绿色玻璃片光滑面利用水贴合载玻片。向样本滴加胶液，盖上盖玻片后，需轻按一下，就可以得到稳定的凝胶装置，静待胶凝固即可。
DAPI等小分子染料不能与生物大分子形成共价键，在膨胀的过程中可能会慢慢丢失，导致信号降低。
此时，对膨胀样本重新进行DAPI染色即可。
不过必须使用双蒸水配置DAPI染液，避免含盐液体导致凝胶收缩，复染过程5min即可。
当一切准备就绪之后，
就到了图像采集环节，
这也是充分体现经验和智慧的⼀步！
这时小伙伴们可能会发现采集的图像
有些区域可能会发生模糊。
这其实是正常现象！
由于3D均匀的拉伸，
细胞样本厚度也会变大。
而光在物质中会发生衍射，
而宽场荧光显微镜缺乏
对样本不同高度光衍射的屏蔽，
采集的图像有些地方就会发生模糊，
特别是在高倍镜的情况下。
在此强调一下，
图像的局部模糊
并不会影响目的区域的清晰度。
如果想用40倍物镜采集整个细胞图像，
需要在不同焦聚下拍摄多张照片，
再对这些照片进行projection处理。
这和共聚焦显微镜的层扫是⼀个道理。
大家快去尝试一下吧！
对HeLa细胞微管(microtubule)固定染色后，再使用雅酶ZX101进行充分的膨胀处理，在倒置宽场荧光显微镜下进行40倍拍摄。
调节细准焦螺旋，在Z轴不同的位置进行拍摄，获得细胞的层扫图片。展示结果如下：
用了雅酶膨胀胶 人手一台共聚焦：http://www.ny-bio.com/cn/nd.jsp?id=1874&id=1874
雅酶膨胀胶试剂盒拍摄指南＆QA合集：http://www.ny-bio.com/cn/nd.jsp?id=1916&id=1916
