正常活细胞的磷脂酰丝氨酸 (phosphatidylserine, PS)只分布在质膜磷脂双分子层的内侧。当细胞开始发生早期凋亡时，细胞膜脂质的不对称性消失，导致PS自质膜内层翻转至外层，从而暴露在细胞表面。Annexin V是一种36 kDa的钙依赖性的磷脂结合蛋白，对PS有高度的亲和性。因此，荧光标记的Annexin V可用于检测暴露于早期凋亡细胞表面的PS。

当细胞处于中晚期凋亡或发生坏死时，由于细胞膜不再完整，细胞膜通透性发生改变。7-AAD (7-Aminoactinomycin D; 7-氨基放线菌素D)、PI（Propidium Iodide;碘化丙啶）核酸染料，可穿过晚期凋亡/坏死细胞细胞膜，与细胞核中的DNA结合。

故事是这样的：

1、关于样本的tips

(1) 培养细胞样本，检测前细胞密度为80%-90%即可，细胞过密会导致细胞出现大量凋亡。

(2) 如果样品来源于血液，必须去除血液中的血小板，因为血小板含有PS，能与Annexin V结合，干扰实验结果。

(3) 神经细胞膜容易破坏外翻，用Annexin-V检测容易导致假阳性。

(4) Annexin V也可以用在植物和细菌中检测凋亡。

2、实验操作

(1)、实验管设置

Tips:为保证仪器参数及荧光补偿的正确调节，空白管和单染管中的待测细胞应同时包括凋亡细胞和正常细胞。若无法确认待测细胞的凋亡程度，可通过热刺激诱导或凋亡诱导剂诱导凋亡后再用于空白管和单染管的检测。

(2)、操作流程：

(3) 、染色后，尽快上机检测，不能及时上机的，4℃条件下避光保存，并在1h内上机检测。

1、细胞有GFP自发荧光

图片来源于Biolegend网站

上图是GFP的光谱图，可见它在530/30、585/20通道都有信号，特别是当GFP荧光比较强的时候，对FITC、PE通道影响都比较大。因此不建议选用含有FITC-Annexin、PI的检测试剂盒。我们推荐使用Annexin V-Alexa Fluor647/7-AAD 凋亡检测试剂盒（Cat：FXP147）。

2、某些凋亡药物具有荧光性

如Doxorubicin，在细胞中累积后，会发出荧光信号，其最大激发波长和最大发射波长为分别为470 nm 、560 nm。因此也不建议选用含有FITC-Annexin、PI的检测试剂盒。我们推荐使用Annexin V-Alexa Fluor647/7-AAD 凋亡检测试剂盒（Cat：FXP147）。

3、凋亡条件的优化

做凋亡实验时，会出现分群不明显的情况，建议大家可以尝试优化凋亡条件。我们尝试了不同条件下，不同细胞的凋亡情况，详情如下：

待Jurkat细胞生长至对数生长期，分别经过紫外诱导0S、15S、30S和60S，培养4h后检测。

可见对于本次实验的Jurkat细胞，紫外诱导30S，流式分群最好。

此外，我们还用不同药物刺激不同细胞，实验结果如下：

可见不同细胞对不同药物的敏感性也大不相同。实验者最好能针对实验样本优化凋亡条件，以得到更好的实验结果。