CRISPR/Cas9文库筛选技术可实现全基因组范围的高通量筛选，其针对每个基因设计3-10条sgRNA，利用芯片一次性合成数万条覆盖整个基因组的sgRNA探针，通过克隆构建载体库，经慢病毒包装后以低感染复数感染宿主细胞，使得理论上每个细胞整合一条sgRNA，构建获得覆盖全基因组的基因敲除细胞池；经过筛选后，提取基因组并针对整合的sgRNA序列进行高通量测序，分析筛选前后sgRNA的丰度变化，进而找出其对应候选基因。
在CRISPR文库筛选实验过程中，最理想的结果就是除了药物，其他刺激的影响越小越好，因此病毒必须高滴度、高纯度、无污染。以下是我们整理的一些关于CRISPR文库筛的常见问题及解决方法。原因①：细胞铺板过密
解决办法①：铺板密度为4–5x10^6 cells/10cm培养皿，如果细胞分裂太快，可适当降低铺板细胞数；在汇合度50–80% 时进行实验解决办法②：转染后 48 小时目的基因才能达到最大表达量，此时再进行转染效率测试
原因①：太早收毒
原因②：未使用 Polybrene，或者不是最佳浓度
解决办法②：转染时加入4μg/ml Polybrene 或者优化最佳浓度 (2–12μg/ml)。解决办法③：每一次冻融滴度会下降2-4倍，因此应减少冻融次数。原因④：滴定测量滴度时没有使用最佳筛选浓度
解决办法④：在检滴度前应确定好细胞的抗性杀伤曲线，以确定最佳筛选浓度。
原因①：低滴度
解决办法①：在不适用超速离心的情况下浓缩病毒至100倍原因②：转染时细胞活性低
解决办法②：
a.病毒包装培养基可能影响细胞生长; 稀释病毒上清或者减少细胞接触病毒时间;b.过度使用Polybrene: 使用滴定的方法确定最佳用量，或 缩短处理时间;c.在转染前先调整好细胞状态;
解决办法③：降低或优化Polybrene浓度; 减少感染时间
2. 细胞转染Cas9病毒后死亡或者生长缓慢
解决办法①：使用目的细胞滴定Cas9病毒以确保一个病毒进入一个细胞，或者使用另外一种对 cas9不敏感的细胞
解决办法：不要超过 AXG500 最大细胞量 (~1x10^8 cells)。细胞量很多的时候要使用多个纯化柱
解决办法①：滴定法测定最佳Cas9病毒浓度; 使用已知编辑效率的sgRNA进行效率测试解决办法②：使用小量文库病毒来优化转染效率
解决办法①：使用小量文库病毒来优化转染效率
解决办法②：过度培养会使 pool产生偏差。在细胞达到最佳筛选数量时就应该实行筛选操作了。
1. 对于MOI本身很高的细胞，应该怎么转染？
如果目标细胞本身的MOI很高，可以尝试使用更低的病毒载量进行转染，以避免过度表达Cas9对细胞的不利影响。在这种情况下，需要进行MOI的优化，以确定最佳的病毒载量。这可以通过逐渐减少病毒载量并测定转染效率来实现。2. CRISPR 文库构建时涂板菌总是长得太少怎么办？
CRISPR 文库构建时涂板菌长得太少的原因以及建议如下：①涂布方法不正确：确保使用新鲜的琼脂和正确的涂布细胞密度。此外，可以尝试使用不同的涂布方法，例如滚涂或喷涂，以提高涂布效率。②DNA量或者文库质量差：使用质量更高的DNA或文库样品重复转化如果这些方法仍然无法解决问题，可能需要重新评估您的菌株和培养条件。3. CRISPR KO文库质粒怎么转化扩增？是需要电转化吗？可以用核转仪做吗？
CRISPR KO文库质粒转化扩增的方法通常使用电穿孔法或化学转化等方法。不建议使用核转仪进行扩增，电穿孔法是目前最高效的质粒转化方法，将质粒DNA与电穿孔细胞混合，并施加电脉冲以促进质粒进入细胞内。电穿孔后，将细胞播种在选择性培养基上，以分离目的质粒的菌落。
4.CRISPR Cas9 library扩增怎么做？序列不出来怎么回事？CRISPR文库扩增通常采用PCR的方法来扩增sgRNA序列，如果序列扩增不出来可能需要重新评估您的PCR反应条件，例如引物浓度、PCR循环参数和反应体系等。此外，如果您使用的是Illumina测序平台，可能需要使用适当的引物和测序方法，以确保正确地测序sgRNA序列。如果您仍然无法获得所需的序列，建议您检查您的文库构建方法和质量，以确保sgRNA序列已正确地插入到文库中。
5. 文库病毒如何确保sgRNA的有效性？
确保病毒文库sgRNA 有效性的措施有：
①设计高质量的sgRNA，从而高特异和高效地靶向目的基因。
②在进行大规模筛选之前先进行试点筛选，来验证sgRNA文库系统的有效性。6. 如何保证文库的sgRNA完整性？
确保文库有足够的覆盖度，每个目标基因的细胞覆盖度取决于筛选的目标。对于阳性选择筛选，每个目标基因的覆盖度为100-200倍，可以将其分解为每个基因4个gRNA，每个gRNA覆盖度为25-50倍。对于阴性选择筛选，需要每个目标基因的覆盖度为500-1000倍，以高灵敏度检测必需的基因。此外，通过与Cas9+细胞系滴定病毒，重要的是确定所需的sgRNA文库病毒量，以达到大约30-40的转染效率。7. 如何控制进入细胞的病毒数？
为了控制CRISPR筛选过程中进入细胞的病毒数，需要确定MOI(感染率)和感染时的细胞密度。MOI是指病毒颗粒数与目标细胞数的比值，可以通过调整加入细胞的病毒量来进行调节。最佳的MOI可能因细胞类型和病毒种类而异，因此需要为每个实验确定适当的MOI，以确保高效的转染而不会引起细胞毒性。此外，感染时的细胞密度也会影响转染效率，因此需要优化细胞密度，以确保适当数量的细胞被感染到所需数量的病毒。通过控制MOI和细胞密度，可以在CRISPR筛选实验中获得一致和可重复的结果。8. 如何检测存活细胞的sgRNA？
检测CRISPR筛选中存活的细胞的sgRNA，可以通过收集细胞并提取其基因组 DNA(gDNA)，然后进行
NGS分析来检测sgRNA。在NGS分析中，可以将sgRNA序列扩增并测序，然后使用软件工具对其进行分析，以确定哪些sgRNA在筛选过程中频率增加或减少。具体地，可以使用Cutadapt软件对测序数据进行修剪，然后将sgRNA序列(20个碱基对)与参考库或对照组进行比对，使用CLC Genomics Workbench确定sgRNA 频率的折叠变化。最后，可以使用Excel等软件对结果进行分析，以确定哪些sgRNA对细胞的生存产生了影响。9. 文库筛选MOI值为什么要偏低(30上下)，才能实现单个细胞中进入一个病毒，具体是什么原理呢？
在CRISPR筛选中，文库筛选MOI值偏低(30上下)的原因是为了确保每个细胞中只有一个病毒进入。在CRISPR筛选中，每个细胞只需要一个病毒进入才能实现单个细胞的基因编辑。如果MOI值过高，即病毒颗粒数与目标细胞数的比值过高，会导致多个病毒进入同一个细胞，从而导致多个基因编辑事件的发生，使筛选结果变得复杂。因此，为了确保每个细胞中只有一个病毒进入，需要将MOI值控制在30左右。这可以通过在小规模实验中优化病毒滴加量来实现，以确保在细胞中只有一个病毒进入的情况下，尽可能多地感染细胞。10. CRISPR筛选的质量控制标准是什么？
为了保证CRISPR筛选结果的准确性，CRISPR筛选的质量控制标准如下：
①sgRNA质粒文库质量：确保sgRNA文库的质量良好，sgRNA序列正确，没有错位或错误。验证 sgRNA序列的准确性和一致性非常重要。②sgRNA覆盖度：检查sgRNA文库的覆盖度，确保每个目标基因都有足够数量和多样性的sgRNA。③细胞系标准化：使用标准化的细胞系，以确保筛选结果的可比性。细胞系的质量和认证也是重要的。④控制实验：进行适当的对照实验，包括阳性和阴性对照，以验证筛选实验的有效性和准确性。⑤sgRNA引入效率：检查sgRNA的引入效率，确保足够数量的细胞成功接受 sgRNA。⑥数据分析：使用合适的统计方法和数据分析工具来处理和解释筛选数据，以确定显著的靶标基因。
11. 全基因组CRISPR文库筛选的周期是多久？
全基因组CRISPR筛选的周期根据具体的实验设计和目标而有所变化，通常包括以下主要步骤：
①sgRNA文库制备：这一步通常需要几周到一个月的时间，具体取决于sgRNA的设计、合成和验证。
②细胞系培养和标准化：在sgRNA文库制备期间，需要培养和标准化用于筛选的细胞系。这可能需要几周时间。
③sgRNA引入和筛选：这个阶段通常需要几天到几周的时间，具体取决于细胞的增长速度以及筛选的持续时间。引入sgRNA并进行筛选可能需要一些时间，确保足够多的细胞被感染。
④数据采集和分析：一旦筛选完成，数据采集和分析阶段可能需要几周或更长时间
总的来说，全基因组CRISPR筛选的周期通常在数月到半年之间，具体取决于实验规模和目标。实际周期可能因实验条件和复杂性而有所不同。因此，在进行全基因组 CRISPR筛选时，要事先制定详细的实验计划，并留出足够的时间来完成每个步骤。海星生物一站式CRISPR文库筛选方案—文库质粒、文库病毒、文库扩繁、sgRNA文库定制、CRISPR文库筛选全套定制服务。
