正能生物：【免疫沉淀】（Immunoprecipitation, IP）实验技巧详解
免疫沉淀实验（Immunoprecipitation, IP）是一种用于研究蛋白质相互作用和结合分析的常用实验技术。它基于抗体的特异性结合，通过沉淀并富集感兴趣的蛋白或其复合物，从而进行后续的分析和研究。免疫沉淀实验可用于研究蛋白质的复合物组装、蛋白质相互作用、信号转导等生物过程的调控机制。它在生物医学研究领域中被广泛应用，也为药物研发和疾病诊断提供重要的实验技术支持。
免疫沉淀原理
IP实验步骤&实验要点
一、准备抗体
选择适当的抗体，可以是单克隆或多克隆抗体，用于特异性地结合目标蛋白。
在IP实验中，抗体需要通过识别抗原的构象表位并与靶蛋白结合沉淀出来，而只能识别线性表位的抗体则无法做到这一点。所以开始IP实验之前，一定要先确定所选抗体适用于IP实验。
IP和WB在抗体稀释比上有不同，IP实验中抗体所需要的稀释比例比WB实验要小的多，一般情况下抗体和靶蛋白的比例要控制在1:10到1:100之间。如果抗体用量过多，可能会造成非特异性结合和背景干扰；如果抗体用量过少，则可能无法充分提取目标蛋白。
二、细胞或组织裂解
将待研究的细胞或组织样品进行裂解，获取蛋白质混合物。
理想的裂解液可以保留蛋白质的天然构象，将抗体结合位点变性减到最少，同时从样本中释放足够的蛋白,以满足实验需求。常规IP实验通常可用RIPA做裂解液:对于Co-IP实验，则建议优先尝试更温和的NP-40或TritonX-100裂解液(RIPA 裂解液可作为备选)。
常规IP裂解是可以超声、涡旋的。Co-IP为尽量减少对蛋白互作的破坏，尽量不超声，可用移液器吹打混匀(短时轻微涡旋亦可,不要太剧烈)
三、免疫反应
将抗体加入裂解液中，使其与目标蛋白结合，形成抗原-抗体复合物。
一般使用抗体裂解液先孵育的方式，靶蛋白得率更高，业内采用这种方式也最常见。如果使用抗体吸附剂先孵育,然后加入裂解物孵育，这种方式的缺点比较明显：加入裂解物后孵育时间若太短、则抗体不能充分的捕获靶蛋白,若时间过长，吸附物与裂解物也容易发生非特异性结合造成背景。
免疫沉淀实验步骤
IP中的同型对照：
在IP实验中，同型对照是为了验证IP实验结果的特异性而设置的。同型对照是指使用与待沉淀目标蛋白无关的抗体作为对照，检验其是否能够与非特异性相互作用产生相似的沉淀结果。同型对照的作用是排除非特异性沉淀信号，以确定IP实验结果中的真正特异性信号。通过在同一样本中进行对比，可以确定来自特定抗体和目标蛋白之间的特异性交互，而不是简单的非特异性结合。同型对照应使用与待沉淀目标蛋白来源相同的抗体类型，例如如果使用小鼠来源的抗体进行沉淀，则同型对照应为小鼠IgG。这样可以确保同型对照抗体在实验条件下与待检测抗体有相似的非特异性结合性质。
四、沉淀
将抗原-抗体复合物与特定吸附剂（如蛋白A/G琼脂糖或磁珠）结合，使复合物沉淀下来。吸附剂可以选择根据抗体的类型和特性来确定，以保证特异性沉淀。
在免疫沉淀实验中，选择合适的固相载体对于有效地沉淀抗原-抗体复合物并分离靶蛋白非常重要。固相载体可以提供一个固定的平台，使抗体能够选择性地结合目标蛋白并将其从混合物中分离出来。
固相载体的选择
免疫沉淀的吸附剂选择：
在免疫沉淀实验中，选择合适的吸附剂对于高效地沉淀抗原-抗体复合物非常重要。吸附剂能够与抗体结合，并帮助将目标蛋白及其相互作用蛋白从混合物中沉淀下来。
蛋白A：蛋白A是一种能够选择性结合到免疫球蛋白（IgG）的细菌蛋白，尤其适用于兔子或小鼠多克隆抗体。蛋白A吸附剂通常以琼脂糖或磁珠的形式供应。
蛋白G：蛋白G也是一种具有高亲和力的细菌蛋白，能够结合大多数哺乳动物IgG，包括人类、小鼠和兔子等多克隆抗体。与蛋白A类似，蛋白G吸附剂通常以琼脂糖或磁珠的形式供应。
抗体捕获珠：抗体捕获珠可以具有固定的蛋白A、蛋白G或其他抗体分子，用于选择性地捕获特定抗体。这种吸附剂非常实用，尤其适用于特定抗体的沉淀。
蛋白L：蛋白L是一种结合到某些哺乳动物免疫球蛋白次类（subclasses）的细菌蛋白，适用于某些特定抗体的沉淀。
磁珠/凝胶珠与抗体的结合
五、洗涤
通过多次洗涤步骤去除非特异性结合的蛋白质，以提高沉淀物的纯度。
洗涤缓冲液的温度应保持在适当的范围内（如4℃），并进行充分混匀，以确保沉淀物与洗涤缓冲液充分接触。此外，洗涤过程中可以采用离心或磁场分离的方式，将沉淀物与洗涤缓冲液分离，以加快洗涤过程和减少操作时间。
六、洗脱
用洗脱缓冲液将目标蛋白及其相互作用蛋白从吸附剂上脱附下来。
加入洗脱缓冲液：将适当的洗脱缓冲液（如SDS-PAGE样品缓冲液或含有高浓度盐的缓冲液）添加到沉淀物中。洗脱缓冲液中的成分会破坏免疫复合物的结合，从而将目标蛋白释放出来。确保洗脱缓冲液的体积足够充分地覆盖沉淀物，并进行彻底的混匀。
洗脱方式图示
Buffer洗脱
这是最常用的洗脱方法之一。通过使用含有SDS（十二烷基硫酸钠）和还原剂（如β-巯基乙醇）的缓冲液，可以有效地解离免疫复合物。SDS可破坏蛋白质间的非共价键，使其解聚，并使蛋白质带有负电荷，从而将目标蛋白从抗体上洗脱出来。此后，可以通过进一步的SDS-PAGE和Western blot等技术进行蛋白质分离和检测。
酸性洗脱
将样品置于酸性条件（如含有醋酸或盐酸的缓冲液）下可以解离免疫复合物，并释放目标蛋白质。这种洗脱方法适用于需要断裂较强的免疫复合物。
竞争性洗脱
该方法利用高浓度的竞争性抗原，将其加入到洗脱缓冲液中，与抗体竞争结合目标蛋白质，从而使抗体与目标蛋白质的结合断裂，实现目标蛋白质的洗脱。
高温处理：将样品加热至适当的温度（通常为95℃），使洗脱缓冲液中的成分进一步破坏蛋白质的结合，促使目标蛋白的解离。通常情况下，加热处理的时间为5-10分钟。
离心分离：将样品离心以分离出洗脱缓冲液中的溶解的目标蛋白。离心的条件（速度、时间）根据实验要求和样品的特性进行调整。
收集洗脱物：将离心后的上清液（洗脱物）转移到新的试管中，以便进一步的分析和检测。洗脱物中含有解离的目标蛋白，可以通过Western blot、质谱分析等技术进行定性和定量分析。
七、分析
通过Western blot、质谱等技术检测和鉴定沉淀的蛋白质，可以进一步研究蛋白质相互作用、信号通路和功能等相关问题。
IP常见问题分析
高背景
没有检测到目的蛋白
免疫沉淀中的轻重链干扰
当进行IP实验时，IP抗体在洗脱后加入loading buffer的变性过程中被破坏了结构，断裂为组成抗体的轻重链。此时若IP抗体种属与WB抗体种属来源相同，变性后的抗体就会被常规Anti-IgG(H+L)二抗识别，显影时就出现了IP抗体变性后产生的轻重链。其中轻链大小为25kDa左右，重链大小为55kDa左右，当目标蛋白分子大小在轻重链附近时，这类信号可能会影响我们对实验结果的判断。
解决方案
选择不同种属来源的一抗分别进行IP和WB实验，然后再选择无种属交叉反应的二抗进行WB实验
捕获抗体采用没有恒定区的纳米抗体。（又称为VHH单抗、单域抗体或重链单体抗体，是一种特殊类型的抗体分子。与传统的抗体相比，纳米抗体的最大特点是其相对较小的大小和单一的抗原结合域。）
VHH单抗
正能ExactBlot™ IP专用二抗
正能生物开发了专用于IP实验的优化二抗，优化后的二抗具有空间特异性，能够识别空间构象表位，只与非变性的WB检测一抗相互结合，而不与变性后失去原本空间表位的捕获一抗结合，因此既不识别抗体重链也不识别轻链，轻松避免了实验干扰。
图1：使用常规Anti-IgG(H+L)，检测时变性后的抗体轻重链均被识别
图2：使用正能- ExactBlot™ IP专用二抗，有效避免轻重链干扰，目的蛋白信号更加清晰
