原因-1. 膜上根本没有蛋白

获取样本后，蛋白提取失败且未进行蛋白浓度检测。

使用BCA法、Folin酚法、Bradford法等方法进行样本蛋白浓度检测，保证样本提取成功。

原因-2. 样本中不表达目标蛋白

对样本中蛋白表达情况并不是很熟悉，可能需要检测的目标蛋白在样本中根本就没有表达。

在参考文献或Uniprot/NCBI上查找对应蛋白的组织表达特异性，分析可能的表达量，判断自己样本中的表达情况。

原因-3. 抗体未结合/抗体失效/一二抗不匹配

一抗鼠源，二抗却选了山羊抗兔；抗体与靶标结合失败；抗体存放不当或存放过久导致失效。

重新选择配对的一二抗；买其他品牌的相同靶标抗体对照试验；将该抗体和样本寄回厂家进行质检。

原因-4. 转膜效率低/失败

膜没有完全活化/靶蛋白分子量小于 10 kd/靶蛋白等电点等于或接近转移缓冲液 pH 值/甲醇浓度过高，蛋白沉淀/转膜时间不够

使用甲醇充分浸透膜，成半透明状后取出，保证其完全活化；选择小孔径的膜，缩短转膜时间；可尝试使用其他缓冲液如 CAPS 缓冲液（pH 10.5) 或使用低 pH 值缓冲液如乙酸缓冲液；降低甲醇浓度或者使用乙醇或异丙醇代替；对于厚的胶以及高分子量蛋白需要延长转膜时间。

原因-1. 封闭不完全

膜的空白部分结合了一抗，导致二抗的非特异性结合，显影曝光导致高背景。

延长封闭时间。

原因-2. 一抗/二抗浓度过高

一抗/二抗浓度过高，导致其与背景特异性结合。

梯度稀释各试剂进行预实验，找到最优体系。

原因-3. 封闭剂选择错误

不合适的封闭剂会导致抗体在背景上与封闭剂非特异性结合。

更改封闭剂种类。

原因-4. 膜处理不当

因为操作不当导致的膜污染/一抗洗脱不完全导致的的高背景。

提高实验技巧，完善实验细节；增加洗脱时间，必要时可加入tween-20。

原因-1. 目标蛋白具有多种修饰形式

磷酸化、甲基化、乙酰化、糖基化等不同修饰作用在同一关键通路枢纽靶标上，此为正常结果。

原因-2. 蛋白表位相似但结构不同

新检测出文献未报到蛋白/同一家族蛋白构型不同/细胞株纯度不够，接受该结果作为分析对象。

原因-3. 细胞传代过多，蛋白表达异常

多次传代发生基因组紊乱，二倍体消失或其他编码表达异常的现象。

原因-4. 多克隆抗体

因为操作不当导致的膜污染/一抗洗脱不完全导致的的高背景。

如果杂带和目标条带距离较远可以进行裁膜处理，如果杂带和目标条带较近无法通过裁膜避免，则需要更换单克隆抗体。

原因-1.抗体对于目标蛋白没有特异性

抗体与蛋白非特异性结合。

更换抗体。

原因-2.蛋白降解

蛋白在提取过程中出现了降解的情况，导致实验失败或非特异性条带出现，通常会同时出现内参条带不清晰的情况。

使用新鲜制备的标本，并使用新配蛋白酶抑制剂，在提取蛋白的过程中全程冰上操作。

原因-1.抗体与封闭剂非特异性结合

封闭剂有杂质，或脱脂奶粉未溶解完全。

增加封闭后的洗涤时间。

原因-2.抗体凝胶非特异性结合

转膜之后膜上残留的凝胶颗粒与抗体非特异性结合。

增加封闭后的洗涤时间。

微笑条带

电泳速度过快 ，电压过高，电泳温度过高，使得胶变形。

通过减少电压等减慢电泳速度，可在冷室或者冰浴中进行电泳或者改变电泳pH。

皱眉条带

凝胶和玻璃挡板底部有气泡，挡板两边聚合不完全。

配胶时充分混匀，排空空气。

某条条带变形

WB结果中其它条带均正常，某条条带出现变形，如下图所示，出现该现象可能的原因是SDS-PAGE胶中有气泡或者不溶性颗粒。

配胶过程中要小心，使用无杂质的液体，同时要注意排除气泡。

哑铃状条带

配置胶有问题，胶凝固后不均一，样品可能含有过多杂质。

重新配置胶，确保胶质量无问题来避免该现象出现；在样品使用前对其进行离心，以去除过多杂质。

条带粘连

出现该现象的原因可能是上样量太多，分离胶和浓缩胶之间有间隙，样品窜孔。

通过减少上样量和提高配胶质量来避免该问题。

条带拖尾

样本中蛋白溶解不好，导致检测结果出现严重的拖尾现象。

加样前煮沸样品，离心取上清进行检测。

条带中间或周围出现白圈

条带中间白圈是由于转膜过程中膜和胶之间存在气泡。

在转膜过程中要尽量去除气泡，使膜，滤纸和胶紧密结合，保持膜的充分浸润。

条带反白现象

一抗浓度过高，二抗上HRP催化活力太强，局部能量消耗过大,导致能量不足,无法发光,使得条带出现反白现象。

降低一抗和二抗浓度。