研究背景
研究思路
2. 在 MEK 信号通路被抑制时,多个基因的遗传缺失或药物抑制能与 MEK 抑制剂协同作用,增强其细胞毒性。
3. 研究人员开发了一种名为 DREBIC(通过体内 CRISPR 筛选评估药物反应)的方法,并利用独立实验的大规模实验数据验证了其效果。
技术路线
1.使用CRISPR基因编辑技术在胰腺癌PDX模型中进行大规模基因敲除筛选,以发现MEK抑制剂的协同靶点。
2.通过体内和体外筛选,发现多个基因敲除与MEK抑制剂协同增加细胞毒性的基因,如CENPE和RRM1,CRISPR文库筛选阴性筛选。
3.使用小分子抑制剂验证基因敲除与MEK抑制剂协同作用,发现CENPE和RRM1是MEK抑制剂的协同靶点。
4.利用长期活细胞成像技术,发现MEK抑制可导致CENPE敲除细胞在有丝分裂过程中发生细胞死亡,揭示了MEK信号与有丝分裂过程之间的相互依赖性。
5.开发了一种新的药物响应预测方法DREBIC,通过整合CRISPR筛选中的基因表达水平和基线基因表达水平,预测细胞对MEK抑制剂的响应。
6.分析验证了DREBIC方法在预测不同组织来源的癌细胞对MEK抑制剂响应方面的准确性和预测能力。
实验结论
1. 使用CRISPR基因编辑技术在胰腺癌PDX模型中进行大规模基因敲除筛选,以发现MEK抑制剂的协同靶点。
体外筛选: 将培养的细胞每3天暴露于对照二甲基亚砜(DMSO)或20%抑制浓度(IC20)剂量的曲美替尼,持续4周。
2. 在所有肿瘤中持续降低的sgRNA靶向关键的有丝分裂细胞周期和着丝点功能,如CENPE,NUF2, MIS12和CENPI。
2.1 癌症基因组图谱(TCGA)分析显示,这两个基因的高表达与PDAC的不良预后显著相关。
注:RRM1编码核糖核苷酸还原酶的催化亚基。由于其在细胞周期和DNA合成中的关键作用。CENPE是一种着丝点相关蛋白,是染色体聚集和有丝分裂检查点信号转导的必需蛋白。
3. 利用CRISPR/Cas9系统对PDX366和mPanc96细胞中的CENPE和RRM1进行了基因靶向并去除,对照、MEK抑制剂(曲美替尼)、CENPE抑制剂(GSK923295)以及MEK抑制剂和CENPE抑制剂联合处理下,PDX366、mpanc96和BxPC3三种不同细胞系的相对活力/生长抑制水平得到了显示。
4. 当CENPE和MEK都被抑制时,有丝分裂延迟略有减少,MEK和CENPE的抑制会导致有丝分裂期间显著的细胞死亡,表明MEK信号通路对于克服有丝分裂延迟期间的凋亡信号是必需的。
5. 评估体内药物协同作用:联合治疗阻断肿瘤的形成,最后,这也会导致肿瘤已经形成后肿瘤体积的显著缩小。
研究结果
本研究中,利用CRISPR筛选技术帮助识别出能够与 MEK 信号抑制剂协同提高胰腺导管腺癌细胞毒性的基因CENPE。