单细胞悬液是流式细胞术对细胞进行分析检测的前提条件。制备过程中，它既要求组织分散成为单个细胞，又要维持细胞的固有属性及生物学特性。外周血细胞或悬浮生长的细胞最适合流式分析，其他样本类型在制备过程中可用的方案较多，本文总结了4种流式样品制备成单细胞样品的实验步骤，供您参考。

流式实验中常采用EDTA或肝素钠抗凝的外周全血。处理方法：1）用溶血素裂解红细胞；2）用Ficoll或Percoll从外周全血中分离PBMCs，从对应密度层获得目的细胞进行清洗和染色。

    1.1.1. 裂红洗涤方案

1. 将适量的表面抗体加至抗凝全血中，室温孵育15min；

2. 加入1×红细胞裂解液，室温避光孵育10min，300-400×g离心 5min，去上清；

3. 加入PBS/流式细胞染色缓冲液，混匀；

4. 按上述条件再次离心并将沉淀分散在PBS/流式细胞染色缓冲液中；

5. 3h内上机检测（若不能立刻上机，用500ul 4%多聚甲醛重悬细胞，4℃避光保存，24h内上机分析）。

    1.1.2. 裂红免洗方案

1. 将适量的表面抗体加至抗凝全血中，室温孵育15min；

2. 加入1×红细胞裂解液，室温避光孵育10min；

3. 混匀，上机检测。

图1：外周全血裂红后双参数点图

1. 用无菌稀释液将血样稀释2-4倍；

2. 在50mL锥底离心管中先加入15-20mL分离液，然后缓慢加入20-30mL经稀释的全血或组织细胞悬液至分离液液面之上；

3. 室温400×g离心15-30min，保证转子速度平稳下降；

4. 将离心管小心地从离心机中取出，缓缓地吸去最上层，避免接触单个核细胞层；

5. 将单个核细胞层缓慢转移到另一只50mL锥底离心管中；

6. 加入无菌洗涤液并混匀后，室温300×g离心10min，小心弃掉上清；

7. 为去除残余血小板，可将细胞重悬于30-50mL无菌洗涤液中，室温200×g离心10-15min，弃上清；

8. 可选择性重复步骤7，以去除绝大部分血小板；

9. 用缓冲液或培养基重悬细胞，进行检测、培养等后续操作。

     注：骨髓样本的实验步骤同外周全血。

图2：人单个核细胞分离液分离（Ficoll配置）外周全血示意图

1. 取适量体积血液于25℃下300×离心10min；

2. 将离心后获得的血浆层，于25℃ 1600×g离心10min；

3. 弃上清，沉淀重悬于Tyrode’s缓冲液或含EDTA的缓冲液中，进行下游实验。

图3：贴壁细胞流式表面染色示意图

更多的组织类型及酶选择请参考下面的网站：

https://www.worthington-biochem.com/tissuedissociation/default.html