流式实验包括实验设计、样品制备、样品染色、样品读取/分析四个步骤,其中样品制备是流式实验的一个重要步骤,影响实验结果的准确性和实验数据的美观性。
流式细胞术实验流程
单细胞悬液是流式细胞术对细胞进行分析检测的前提条件。制备过程中,它既要求组织分散成为单个细胞,又要维持细胞的固有属性及生物学特性。外周血细胞或悬浮生长的细胞最适合流式分析,其他样本类型在制备过程中可用的方案较多,本文总结了4种流式样品制备成单细胞样品的实验步骤,供您参考。
01
外周全血
流式实验中常采用EDTA或肝素钠抗凝的外周全血。处理方法:1)用溶血素裂解红细胞;2)用Ficoll或Percoll从外周全血中分离PBMCs,从对应密度层获得目的细胞进行清洗和染色。
1.1外周全血裂红实验方案
1.1.1. 裂红洗涤方案
将适量的表面抗体加至抗凝全血中,室温孵育15min;
加入1×红细胞裂解液,室温避光孵育10min,300-400×g离心 5min,去上清;
加入PBS/流式细胞染色缓冲液,混匀;
按上述条件再次离心并将沉淀分散在PBS/流式细胞染色缓冲液中;
3h内上机检测(若不能立刻上机,用500ul 4%多聚甲醛重悬细胞,4℃避光保存,24h内上机分析)。
1.1.2. 裂红免洗方案
将适量的表面抗体加至抗凝全血中,室温孵育15min;
加入1×红细胞裂解液,室温避光孵育10min;
混匀,上机检测。
图1:外周全血裂红后双参数点图
1.2 外周血单个核细胞分离
用无菌稀释液将血样稀释2-4倍;
在50mL锥底离心管中先加入15-20mL分离液,然后缓慢加入20-30mL经稀释的全血或组织细胞悬液至分离液液面之上;
室温400×g离心15-30min,保证转子速度平稳下降;
将离心管小心地从离心机中取出,缓缓地吸去最上层,避免接触单个核细胞层;
将单个核细胞层缓慢转移到另一只50mL锥底离心管中;
加入无菌洗涤液并混匀后,室温300×g离心10min,小心弃掉上清;
为去除残余血小板,可将细胞重悬于30-50mL无菌洗涤液中,室温200×g离心10-15min,弃上清;
可选择性重复步骤7,以去除绝大部分血小板;
用缓冲液或培养基重悬细胞,进行检测、培养等后续操作。
注:骨髓样本的实验步骤同外周全血。
图2:人单个核细胞分离液分离(Ficoll配置)外周全血示意图
1.3 外周血中血小板富集的血浆制备
取适量体积血液于25℃下300×离心10min;
将离心后获得的血浆层,于25℃ 1600×g离心10min;
弃上清,沉淀重悬于Tyrode’s缓冲液或含EDTA的缓冲液中,进行下游实验。
02
培养细胞
图3:贴壁细胞流式表面染色示意图
03
组织
3.1 淋巴组织
将脾、胸腺或淋巴结采集到含缓冲液或培养基的细胞培养皿中,用注射器活塞在细胞筛网上研磨;
使用PBS冲洗细胞滤网,滤掉细胞团块和碎片;
4˚C 300-400×g离心5min,弃上清;
用适当体积的缓冲液重悬细胞,进行细胞计数和活性检测,并调整细胞浓度至107个/mL,进行下游实验。
更多的组织类型及酶选择请参考下面的网站:
https://www.worthington-biochem.com/tissuedissociation/default.html
参考文献
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04
Lynn G. Dressler and Dan Visscher. Handling, Storage, and Preparation of Human Tissues, Current Protocols in Cytometry (1997) 5.2.1-5.2.15
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