海星生物：sgRNA的设计与质粒构建方法
sgRNA在CRISPR-Cas9基因编辑系统中具有准确识别靶基因序列的作用，其效果可影响编辑的效率、是否发生脱靶等，甚至对最终基因编辑的效果产生决定性作用。因此，设计合理有效的sgRNA是我们实现基因编辑的重要基础。sgRNA包括20nt的靶向序列，crRNA，linker loop 和 tracrRNA几个部分共同组成（图1）。通常我们所说的sgRNA设计指的就是针对20nt的靶向序列进行设计，而选择合适的靶向序列就是sgRNA设计的核心工作。
sgRNA的设计流程
sgRNA的设计原则
1. 特异性：确保sgRNA是特异性的，以免在基因组中发生非特异性的编辑。避免选择与其他基因序列相似的区域，特别是避免在基因组中存在多个拷贝的区域。
2. sgRNA的长度：S. pyogenes II型CRISPR系统（SpCas 9）一般为20nt。
8. 构建T7/U6启动子驱动sgRNA表达载体时，需注意sgRNA的5'碱基最好为G，或者人为添加一个G来提高其转录效率。
10. 当基因存在多个转录本时，最好将sgRNA设计在同源区域。
sgRNA的设计
此处以查询人类WNT10B基因为例。在NCBI Gene数据库中输入需要查找的人类WNT10B基因，查找的结果显示多个与WNT10B相关的基因，这些基因包括了不同物种的WNT10B同源基因。因而查找时需要注意该基因在NCBI的登录号与种属描述等。点击查询人类WNT10B基因，显示出该基因的基本信息（图1）。
(图1) NCBI网站查询WNT10B基因信息
找到该基因的mRNA and Protein(s) 相关信息，查询可知WNT10B的mRNA 编号为 NM 003394.4。如果该基因可以通过可变剪接产生多个mRNA亚型的话，在下图中会依次记录（图2）。
（图2）NCBI网站查询WNT10B基因mRNA信息
使用SnapGene软件对基因序列信息进行分析，如下图所示,WNT10B基因一共包含4个外显子，其中粉色区域为信号肽所在序列，该序列在蛋白质翻译加工过程中会被切除，sgRNA设计时应避免此段序列，最左边的的外显子序列也不参与蛋白质的翻译，也应该避免采用此段序列，所以最佳的sgRNA靶向序列应采用图中蓝色选定区域（图3）。
（图3）WNT10B基因结构组成图示
选取上图中序列作为sgRNA的靶序列，在sgRNA设计网站输入靶基因信息和设计相关信息。
现在有多种sgRNA设计网站可供选用，常用的设计网站包括：
1. CRISPOR（http://crispor.tefor.net/）
2. GPP Web Portal （https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public/）
3. E-CRISP （http://www.e-crisp.org/E-CRISP/）
4. CHOPCHOP （http://chopchop.cbu.uib.no/）
此处我们选择张锋实验的CRISPOR（http://crispor.tefor.net/）来进行sgRNA的设计，输入上文选择的靶序列，选定基因对应的物种信息和想要使用的Cas9和PAM种类后点击提交（图4）。
（图4）sgRNA设计网站界面
网站生成的sgRNA序列和相关信息如下图所示，信息包括sgRNA的位置，网站给出的特异性评分，切割效率评分，潜在的脱靶结果和脱靶位点相关信息（图5）。
（图5）网站生成的sgRNA方案和分析
sgRNA质粒的构建方法
LentiCRISPR-V2质粒有两个BsmBI酶切位点，通过使用BsmB内切酶I，我们能够打开所需的区域。酶切条件遵循内切酶说明书，随后进行胶切、回收并备用。
试剂 | 使用量 |
oligo 1 (100μM) | 1ug |
oligo 2 (100μM) | IμL |
T4 Ligation Buffer(NEB) | 1μL |
ddH2O | 6.5μL |
T4 PNK (NEB) | 0.5μL |
总体系 | 10μL |
37℃ 30 分钟，95℃ 5 分钟，然后以每分钟降低5℃的速度将温度降到25℃
体系：一般室温放置20-30分钟（NEB的快速T4连接试剂盒）
样品 | 使用量 |
XμL | |
第3步中磷酸化与退火后的引物(1:100稀释) | 1ul |
2XQuickligation Buffer (NEB) | 5ul |
Quick Ligase (NEB) | 1μL |
ddH20 | XμL |
subtotal | 10 μL |
Quick Ligase (NEB) | 1 μL |
Total | 11 μL |
④ 以3000 r/min离心3分钟，弃掉上清，利用冷却至室温的玻璃棒涂布培养皿（AMP抗性），随后在37℃培养箱中过夜生长。
5. 挑取单克隆，摇菌，菌落PCR。
6. 对PCR生成物进行琼脂糖凝胶电泳，运用凝胶成像仪进行成像，并挑选阳性菌落将其送往测序公司进行测序鉴定。
7. 基于测序结果挑选目标菌落进行扩大培养，提取质粒以备用于后续实验室实验。