在流式细胞术（Flow Cytometry）实验中，去除粘连细胞是确保数据准确性的关键步骤。粘连细胞（两个或多个细胞黏附形成的聚集体）会导致流式细胞仪对事件数、荧光强度及细胞周期分布的判定出现偏差,从而降低实验结果的可靠性。以下从重要性、适用场景、使用方法三方面展开说明。

一、去粘连细胞的重要性

1.避免事件计数偏差

粘连细胞会被流式细胞仪识别为单个事件，造成细胞计数虚高。例如，两个二倍体细胞粘连可能被误判为一个四倍体细胞，导致 G2/M 期比例显著偏高；在细胞分选时，粘连体还会降低目标细胞纯度，例如非荧光标记细胞可能混入阳性群体。

2.确保荧光信号准确性

粘连细胞的荧光信号是多个细胞的叠加，可能掩盖亚群的真实表达水平。例如，一个阴性细胞与一个弱阳性细胞粘连时，可能被误判为中等阳性，导致表型分析偏差。

3.减少仪器损伤风险

大量粘连细胞可能堵塞流式细胞仪的喷嘴或管路，影响仪器性能并增加维护成本。

二、适用场景

1.样本制备过程可能产生细胞粘连

①组织解离样本：如实体瘤、器官组织等经酶解或机械解离后，容易产生细胞团块或粘连。

②细胞培养样本：细胞密度过高、消化不充分或细胞外基质残留时，可能形成细胞簇。

③血液 / 体液样本：凝血或白细胞聚集可能导致细胞粘连（如未充分抗凝的血液）。

2. 需精确分析单个细胞的荧光信号

①细胞周期分析（如 PI 染色）：粘连细胞可能被误判为多倍体细胞，影响周期分布结果。

②表面标志物检测（如 CD 分子）：粘连细胞的荧光强度可能叠加，导致亚群比例计算偏差。

③稀有细胞检测（如循环肿瘤细胞 CTCs）：粘连细胞可能掩盖稀有细胞的真实信号。

3. 避免非特异性荧光干扰

粘连细胞可能因荧光信号重叠（如不同染色的细胞粘连），导致假阳性结果（如双阳性细胞比例虚高）。

三、常规去粘连细胞的方法

（一）样本处理优化

机械分散与过滤

方法：轻柔吹打或使用细胞筛（如 40 μm 尼龙滤网）过滤单细胞悬液，去除预成型团块。对于组织样本，可结合振荡解离（如轨道摇床）促进分散。必要时可采用多级过滤，从100 μm、70 μm至40 μm依次过滤样品，避免过滤期间的过滤器堵塞。^[1]

酶解消化

方法：根据组织类型选择酶解方案：

1.贴壁细胞：胰蛋白酶（Trypsin）或 TrypLE 消化，需严格控制时间（通常 < 5 分钟）以避免过度损伤细胞膜抗原。

2.实体组织：胶原酶（Collagenase）与 DNase I 联用，分解细胞外基质并降解游离 DNA（防止黏性聚集）。例如，在消化液（含50 U/mL DNase I和0.8 mg/mL胶原酶IV）中于37°C孵育1-2小时（肠道、肺和肿瘤组织）或6-12小时（皮肤），将组织解离为单细胞悬液。^[2~5]

3.球体或肿瘤组织：Accumax 等商业化试剂结合轻柔吹打，可在 10 分钟内将球体解离为单细胞，单细胞率 > 95%。

（二）流式检测阶段的电子排除

1.基于散射光参数设门

方法：利用前向散射光面积（FSC-A）与高度（FSC-H）或宽度（FSC-W）的差异排除粘连体。单细胞的 FSC-A 与 FSC-H 呈线性关系（位于对角线），而粘连体因面积增加但高度不变，会偏离对角线。

操作步骤：

①在 FSC-A vs SSC-A 散点图中圈定目标细胞群（如淋巴细胞），排除碎片和死细胞。

②将目标群体显示于 FSC-A vs FSC-H 散点图，围绕对角线画门（Singlets 门），排除右下角的粘连体。

例如：在对8月龄C57BL/6J小鼠外周血进行流式细胞术分析的实验中，对研究人员老年慢性感染小鼠的CD8 T细胞亚群进行分类，分群策略如下：^[1]

2.荧光通道设门

方法：对于做细胞周期的样本结合荧光脉冲宽度（如 FL2-W）进一步验证单细胞。例如，PI 染色检测 DNA 含量时，粘连体的 FL2-W 值显著高于单细胞。特别适用于细胞周期分析（如 PI 染色）：粘连细胞可能被误判为多倍体细胞，影响周期分布结果。

设门步骤：

1.先进行基础设门：通过前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC）圈选细胞群体，排除碎片和杂质。

2.绘制荧光 A/H 散点图：选择目标荧光通道（如 FITC、PE 等），观察细胞分布。

3.设定阈值门：根据荧光 A 与 H 的比例，手动或自动划定单个细胞区域（通常为斜率≈1 的对角线区域）。

例如：Bio-Protocol中，涂溢晖，王雪冬等通过对比不同处理组（如正常细胞 vs 药物处理细胞）的 PI-A/PI-W 分布，证明该方法可有效区分 G0/G1 期（PI-A=4N）与 G2/M 期（PI-A=8N）的单细胞，同时排除因药物诱导凋亡导致的粘连体干扰。^[6]

3.优化方案

当样本为实体样本，情况比较复杂是，建议通过FSC-H与FSC-W、SSC-H与SSC-W的门控排除双阳性细胞，

例如：用流式方法检测Tcrd-H2BeGFP小鼠腹腔淋巴结（pLN）中的γδ T细胞实验中，我们看到作者在FSC-A与SSC-A图中定义淋巴细胞。随后，通过FSC-H与FSC-W、SSC-H与SSC-W的门控排除双阳性细胞，并进一步排除死亡细胞。^[1]

图A展示了小鼠pLN中Vγ4+（红色）和Vγ6+（绿色）γδT细胞的代表性分选策略，图B则呈现耳部皮肤中表皮小鼠Vγ5+ γδ T细胞(DETCs，红色）与真皮层小鼠Vγ4+、Vγ6+ γδ T细胞（蓝色）的分选结果。反向分选首先通过FSC-A与SSC-A图谱对淋巴细胞进行初始分选，随后通过FSC-H与FSC-W、SSC-H与SSC-W图谱排除双阳性细胞，并剔除DAPI阳性或Zombie-Aqua+染色的死细胞。在针对TCRß-细胞的分析中，首先筛选出总γδ TCR +CD3+ γδ T细胞，最后通过抗-Vγ4抗体和17D1抗体染色，结合偶联抗IgM抗体检测Vγ6+/Vγ5+ γδ T细胞，从而实现不同亚群的精准分群。

四、总结

去除粘连细胞是流式实验的关键质控步骤，需结合样本类型优化物理、酶解及化学处理方法，并通过流式参数设门排除残留粘连体。通过上述方法，可显著提高单细胞悬液质量，确保流式检测结果的准确性和可重复性。

参考文献

[1]Andrea Cossarizza et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (third edition) Eur. J. Immunol. 2021. 51: 2708–3145.DOI: 10.1002/eji.202170126

[2]Sathaliyawala, T., Kubota, M., Yudanin, N., Turner, D., Camp, P., Thome, J. J. C., Bickham, K. L. et al., Distribution and compartmentalization of human circulating and tissue-resident memory T cell subsets. Immunity 2013. 38: p. 187–197.

[3]Hombrink, P., Helbig, C., Backer, R. A., Piet, B., Oja, A. E., Stark, R., Brasser, G. et al., Programs for the persistence, vigilance and control of human CD8(+) lung-resident memory T cells. Nat. Immunol. 2016. 17: 1467–1478.

[4]Oja, A. E., Piet, B.,Helbig, C., Stark, R., van der Zwan, D.,Blaauwgeers, H., Remmerswaal, E. B. M. et al., Trigger-happy resident memory CD4(+) T cells inhabit the human lungs. Mucosal Immunol. 2018. 11: 654–667.

[5]Du, W., Lenz, D., Köhler, R., Zhang, E., Cendon, C., Li, J., Massoud, M. et al., Rapid Isolation of Functional ex vivo Human Skin TissueResident Memory T Lymphocytes. Front. Immunol. 2021. 12: 624013.

[6]Tu, Y. H., Wang, X. D., Ding, Y. B. and Bian, W. (2019). Cell Cycle Analysis by Flow Cytometry. Bio-101 e1010328. Doi: 10.21769/BioProtoc.1010328.