在当今生命科学研究中，CRISPR筛选技术已成为解析基因功能的利器，而空间转录组学则能揭示细胞在组织中的空间位置信息。然而，传统方法面临一个根本性挑战：如何在保留细胞空间位置的同时，精准解析基因扰动对转录组和细胞功能的影响？

2025年，麻省理工学院和哈佛大学博德研究所和波士顿大学联合在《Cell》上发表了题为“Simultaneous CRISPR screening and spatial transcriptomics reveal intracellular, intercellular, and functional transcriptional circuits”的研究论文，Samouil L. Farhi 的团队开发了Perturb-FISH 技术，首次实现了在单细胞分辨率下同步进行CRISPR筛选、空间转录组分析和功能表型记录。

该技术的核心突破在于：利用改造的慢病毒载体（含U6-T7启动子）实现gRNA的原位转录扩增，结合多重误差稳健荧光原位杂交（MERFISH）对gRNA和mRNA进行条形码编码与空间定位，从而在保留组织空间结构的同时，关联基因扰动与转录组变化。与Perturb-seq相比，Perturb-FISH不仅能捕获细胞内在的基因调控效应，还能揭示细胞密度依赖的免疫应答异质性、肿瘤-免疫细胞互作等空间依赖表型。

1. 原位gRNA扩增与编码检测：

· 巧妙的载体设计： 改造常用的慢病毒gRNA载体 (lentiguide-puro)，在驱动gRNA表达的U6启动子与gRNA序列之间插入一个T7噬菌体启动子。

· 双重作用： 在活细胞中，U6启动子正常驱动gRNA表达，引导CRISPR-Cas系统进行基因编辑（KO或KD）。细胞固定后，利用

2. 并行空间转录组分析： 在同一固定样本、同一套成像流程中，利用MERFISH技术，使用另一套预先设计的编码探针库，同时对数百个目标mRNA分子进行空间分辨的定量检测（图1A）。

3. 兼容功能性成像： 在进行固定和Perturb-FISH之前，可先对活细胞进行功能性成像（如钙离子动态记录）。通过图像配准技术，将功能表型（如特定的钙信号模式）与同一细胞后续检测到的gRNA扰动身份及其空间转录组关联起来。

图1.Perturb-FISH允许在细胞的空间环境中记录gRNA和转录组

与Perturb-seq的高相关性

研究者使用了一个靶向35个基因的小型gRNA库（74gRNAs）对THP-1进行扰动，使其分化成巨噬细胞，在经典模型——脂多糖（LPS）刺激中验证Perturb-FISH，并与已有的Perturb-seq数据严格比对。

·细胞内效应高度一致：Perturb-FISH在两个独立实验重复中检测到的基因（MAP3K7、IRAK1、TRAF6、RELA）扰动效应高度自洽（关键基因效应Pearson相关系数达85-93%）。更重要的是，其检测到的显著效应与Perturb-seq结果高度吻合（关键基因相关系数75-87%，所有显著效应整体相关性73%），且全局调控结构（如NF-κB通路核心基因对TNF、IL1A等细胞因子的强烈下调）在两种方法间一致（图2A-C）。

· 高效能：统计分析显示，每个扰动靶点仅需20-50个细胞，Perturb-FISH即可达到与Perturb-seq相当的统计效力来推断可靠效应（图2D）。这极大提升了在珍贵样本（如原代细胞、类器官、体内组织）中应用的可能性。

图2. Perturb-FISH稳健性和功效分析

Perturb-FISH恢复了基因扰动的细胞外效应

先前的数据强调，Perturb-FISH至少可以像Perturb-seq一样恢复遗传扰动的细胞内效应。研究者接下来研究原位方法提供的额外信息，特别是局部细胞密度对基因表达的影响。THP-1在玻璃表面生长会自发形成密度不均的区域，研究者观察到某些基因的表达高度依赖于细胞密度。特别是，标志LPS反应基因TNF和IL1A的表达随着细胞近邻的数量而显著变化。通过qPCR和单分子RNAscope技术，研究者验证基因扰动的效应因密度而异，如NFKB1 KO细胞在低密度时过表达TNF，而在高密度时反而抑制TNF（图3D）。这种依赖微环境的调控机制对于理解炎症反应的局部调控和平衡至关重要。

为确定基因扰动对邻近细胞间相互作用的影响，研究者选择了接受了对照gRNA（未靶向任何基因）的细胞，发现9种基因扰动会显著影响了邻近对照细胞的基因表达，如MYD88 KO细胞导致邻近细胞中TNF(LFC=0.83)和CD14(LFC=0.77)表达上调（图3E）。揭示了巨噬细胞在应对感染时存在复杂的细胞间基因调控网络，为理解组织水平的免疫协调提供了全新视角。

图3. 密度依赖性和细胞间效应的Perturb-FISH分析

功能筛选：探究破坏性钙活性中自闭症风险基因网络

为了证明Perturb-FISH匹配扰动数据与功能成像的能力，研究者随后将其应用于研究自闭症谱系障碍（ASD）风险基因及其在星形胶质细胞中调节基因表达和钙活性的作用，靶向127个高外显率ASD风险基因进行CRISPRi。在ATP刺激下，对76,400个细胞进行了活细胞钙成像（记录细胞质钙离子浓度动态），钙信号轨迹特征将细胞分为6种功能表型群（图4A）：Large Peak (大峰)、Inactive (静息)、Large Early Transient (大早期瞬变)、Small Peak (小峰)、Step (阶梯状)、Delayed (延迟响应)。其中，“大峰”表型与之前报道的ASD患者星形胶质细胞异常钙活动模式相似。

Perturb-FISH 同时读取的 mRNA 表达信息能够识别出与每个功能簇相关的表达谱。每个钙表型群具有独特的基因表达特征（图4D），如“大峰”群细胞显著下调钙结合相关基因（S100A6、IL6ST、LTBP1）及突触功能相关基因（SYNGAP1、SLC1A3等）。

分析特定钙表型群中gRNA的富集/缺失，发现ASD风险基因的敲低会驱动细胞偏向特定的钙表型（图4C），Perturb-FISH还能整合三种模态数据：

USP9X-KD：导致下游基因（FAM126A、NACC1、P4HA1、DPYSL2、FKBP10、IL6ST、LTBP1）表达改变，这些基因在“大峰”表型中也呈现一致的表达变化。其中多个基因（NACC1、FKBP10、DPYSL2、P4HA1、USP9X本身）涉及mTOR信号通路（一个近期被高度怀疑与ASD发病相关的通路）。这表明USP9X可能通过调控mTOR通路影响星形胶质细胞钙信号，参与ASD病理。

TRIP12-KD：下调ITGAV和ZMYND8，上调EZR表达；而这三种基因在“阶梯状”表型中分别呈现上调、上调和下调的表达特征。相应地，TRIP12 KD细胞在该表型中缺失。

CREBBP-KD：上调RAS同源物RHOC表达，而RHOC在“静息”表型中过表达。CREBBP已知可增强RAS/RAF/MEK/ERK通路，并通过cAMP介导钙信号影响星形胶质细胞功能。这些结果首次在单细胞水平系统性地将大量ASD风险基因与星形胶质细胞功能异常（钙信号）及下游分子通路联系起来，挑战了星形胶质细胞仅在ASD中被动响应的传统观点，提示其在疾病发生中的主动作用。

图4.星形胶质细胞中ASD风险基因在产生不同钙活性

表型中的作用的Perturb-FISH分析

肿瘤微环境：探究免疫缺陷小鼠移植的人黑素瘤细胞中的NF-κB 信号通路

为了探索Perturb-FISH在更复杂的组织环境中的效用，研究者用上述的小型gRNA库扰动A375细胞，并将其注射到植入PBMCs的免疫缺陷（NOD scid gamma, NSG）小鼠侧腹，形成人源化肿瘤模型，鉴定到2022个显著的细胞内在效应（图5A）。Perturb-FISH成功在肿瘤组织切片中绘制了空间分辨的CRISPR扰动图谱和免疫肿瘤相关基因表达图谱（图5B,C），清晰区分肿瘤细胞区域和T细胞浸润区域，并观察到克隆性生长的扰动细胞群。

研究者还关注了T细胞的基因表达如何受到邻近癌细胞扰动的影响，发现276个显著的细胞间肿瘤免疫效应，当将数据随机分成两半来检查一致性时，这些效应仍然相关（图5D）。

IRAK1,LBP, TAB2-KO：在肿瘤细胞中敲低这些基因，导致T细胞活化标志物（TNFRSF9、ZBED2）及CD8A、TIGIT等基因表达显著下调。这些基因高表达与不良预后相关。

CHUK,MAP2K2-KO：在肿瘤细胞中敲低这些基因，导致邻近T细胞中TNFRSF9、ZBED2等基因表达上调。MAP2K2 KO还导致T细胞中免疫检查点配体PD-L1(PDCD1LG2)上调(LFC=0.2)及细胞毒性标志物GNLY下调(LFC=-0.29)。值得注意的是，MAP2K2基因突变与黑色素瘤免疫检查点抑制剂治疗失败有关。

图5.异种肿瘤移植中NF-κB通路的Perturb-FISH筛选

Perturb-FISH的诞生标志基因功能研究进入“空间-功能整合”新纪元，首次在单细胞分辨率、空间原位环境下同步高通量解析基因扰动、转录组响应、细胞间互作及动态功能表型，细胞内效应检测媲美Perturb-seq，更解锁空间与功能维度。其揭示免疫应答受局部细胞密度和通讯调控，ASD风险基因在星形胶质细胞汇聚特定通路调控钙信号及突触基因，肿瘤细胞通过特定通路塑造免疫抑制微环境。该技术兼容CRISPRKO/i，可扩展至CRISPRa、碱基编辑等，gRNA编码策略可扩展性与MERFISH相当，支持数百种扰动并行检测。随着空间转录组技术通量提升及成本优化，其将应用于器官发育、神经回路等复杂问题的细胞互作网络研究，结合活细胞代谢等多维表型成像，将绘制动态“细胞社会”全景图。

Perturb-FISH技术的落地依赖于高通量筛选和功能检测的协同，而海星生物作为生命科学解决方案提供商，可在多个环节提供专业服务。

载体构建：可2周内完成U6-T7-gRNA载体构建

CRISPR文库构建：全基因组文库、聚焦文库（如激酶、代谢基因）和定制文库，支持质粒构建、慢病毒包装、文库细胞株、oligoPool合成和全套筛选服务

细胞平台：Cas9细胞构建，人和小鼠原代细胞提取，细胞永生化，肿瘤类器官构建和其他细胞生物学技术服务

功能检测平台：流式细胞术，WB，免疫荧光等

原文：https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(25)00197-7?rss=yes