因此，亟需能在基因组尺度识别人类蛋白的RNA中心功能、灵活捕获多种RNA代谢事件的筛选方法。华盛顿大学Arvind Rasi Subramaniam团队开发了ReLiC（RNA-linked CRISPR）技术，其成果“Decoding post-transcriptional regulatory networks by RNA-linked CRISPR screening in human cells”发表于《Nature Methods》。

将CRISPR介导的基因扰动与带有条形码的RNA报告系统相结合。利用CRISPR技术对特定基因进行扰动，同时通过条形码标记RNA，使得在基因发生变化时，能够追踪和分析与之关联的RNA的变化情况，从而研究基因对RNA代谢过程的影响。

构建靶向2,092个人类已知RNA相关蛋白编码基因的双sgRNA文库，每个基因对应四个sgRNA对，并为每个sgRNA对连接随机的N20条形码。使用Bxb1介导的位点特异性整合策略，将编码Cas9、sgRNAs和带有条形码的RNA报告基因的质粒文库，稳定地整合到人类细胞的特定基因组位点，实现从特定基因组位点稳定表达多组分物质。在整合完成后，通过添加强力霉素（Dox）诱导Cas9表达，从而启动对目标基因的敲除。在不同时间点收集细胞样本，分别提取基因组DNA和RNA，用于后续分析条形码的变化（图1）。

图1. ReLiC筛选技术的发展

翻译是mRNA 转化为蛋白质的关键步骤，其效率与核糖体在 mRNA 上的占据状态（多聚核糖体与单核糖体的比例）直接相关。传统研究多聚焦于核糖体自身组分或经典翻译因子，研究团队将带有随机条形码的β-珠蛋白（β-globin）基因整合到ReLiC文库中，在HEK293T细胞中诱导Cas9表达7天后，通过蔗糖梯度离心分离核糖体结合的mRNA（单核糖体、轻多聚核糖体、重多聚核糖体），并通过条形码测序分析不同基因敲除对核糖体占据状态的影响。

筛选采用MAGeCK工具分析条形码在各组分中的比例变化，以假发现率（FDR）<0.05且至少3个sgRNA一致变化为标准，最终鉴定出影响核糖体占据的关键基因。

关键发现：核糖体亚基与蛋白稳态的协同调控

1. 核糖体组分的差异化作用

筛选发现，304个基因敲除会降低重多聚核糖体/单核糖体比例，其中细胞质核糖体蛋白和核糖体生物合成因子高度富集（图2c、d）。进一步分析显示，大核糖体亚基（60S）相关基因敲除对多聚核糖体比例的降低作用，显著强于小核糖体亚基（40S）相关基因——前者会导致mRNA滞留于单核糖体中，而后者则使mRNA更多游离于上清（未结合核糖体），这与“小亚基缺失阻碍mRNA-核糖体结合，大亚基缺失仅影响延伸”的机制一致（图2e）。

2. 翻译起始因子的分级调控

多数翻译起始因子（如EIF2、EIF3）的敲除会降低多聚核糖体比例，但影响幅度小于核糖体蛋白。值得注意的是，EIF3复合体的7个亚基（A-E、G、I）敲除后，多聚核糖体比例的下降程度与HeLa细胞中siRNA敲除实验结果高度一致，验证了筛选的可靠性。而EIF4F复合体（如EIF4E、EIF4A）虽对细胞生长至关重要，却未被鉴定为关键调控因子，提示其在翻译起始中的作用可能因mRNA类型而异。

3. 蛋白酶体与TRiC伴侣蛋白的意外角色

最令人意外的发现是：蛋白酶体（如PSMA4）和TRiC伴侣蛋白（如TCP1）亚基的敲除，会导致多聚核糖体比例大幅下降，其影响与核心翻译起始因子相当（图2f）。通过单独构建敲除细胞系验证发现，这两种复合体的缺失会在3天内显著降低整体多聚核糖体比例，且这种作用并非源于其“必需基因”的属性——其他必需复合体（如RNA聚合酶II、SF3剪接复合体）的敲除并未产生类似效果。

这一结果揭示了翻译与蛋白稳态的紧密关联：蛋白酶体负责降解错误折叠蛋白，TRiC参与新生肽折叠，二者的功能缺陷可能通过反馈机制抑制翻译效率，形成“翻译-折叠-降解“的协同调控网络。

ReLiC的筛选结果突破了“翻译仅由核糖体和经典起始因子调控”的传统认知，将蛋白酶体、TRiC等蛋白稳态相关因子纳入翻译调控网络。这为理解肿瘤细胞中“翻译亢进与蛋白稳态失衡共存”的现象提供了新线索——例如，蛋白酶体抑制剂可能通过抑制翻译效率影响癌细胞增殖，为联合治疗提供理论基础。

二、剪接调控：SF3B复合体亚基的功能分化

RNA剪接是真核生物基因表达的关键步骤，通过去除内含子、连接外显子产生成熟mRNA，其异常与多种疾病（如癌症、罕见病）相关。传统剪接筛选依赖荧光报告基因，假阳性率高。研究团队以β-珠蛋白基因为模型，其mRNA存在三种主要剪接异构体：内含子1保留（i12）、内含子2保留（i23）、外显子2跳跃（e13）（图3a、b）。他们设计了针对每种异构体的特异性PCR引物，在Cas9诱导后1、3、5、7天选择性扩增带有条形码的异构体片段，通过测序分析基因敲除对各异构体比例的影响。

关键发现：SF3B复合体的亚基功能分化

1. 剪接调控因子的特异性

筛选发现，影响内含子保留（i12、i23）的基因主要是核心剪接体组分（如U2 snRNP、三联snRNP复合体），而促进外显子跳跃（e13）的基因则集中于SF3B复合体和核蛋白输入因子（图3e）。例如，剪接体激活因子CDK11B的敲除会显著增加内含子保留，而U6 snRNA转录所需的BRF2敲除则主要影响外显子跳跃，提示剪接过程的不同步骤由独立因子调控。

2. SF3B亚基的差异化作用

SF3B复合体是U2 snRNP的核心组分，由7个亚基（SF3B1-SF3B7）组成，其突变与多种癌症相关。ReLiC筛选首次发现，不同亚基的敲除对剪接的影响存在显著差异：

☆ SF3B1、SF3B2、SF3B3、SF3B5敲除会大幅增加外显子2跳跃（e13）；

☆ SF3B6、SF3B7敲除主要促进内含子2保留（i23）；

☆ SF3B4敲除对两种异构体均无显著影响（图3f）。

这一差异在内源mRNA中得到验证：SF3B5敲除会导致45个内源基因的外显子跳跃增加10%以上，而SF3B6敲除仅影响不到10个基因的外显子跳跃，但二者均会增加内含子保留（图3g）。

3. NMD与剪接的偶联

内含子1保留（i12）的异构体因包含提前终止密码子（PTC）和下游外显子连接复合物，会被无义介导的降解（NMD）通路清除。筛选发现，NMD核心因子（如UPF1、SMG1）和外显子连接复合物组分（如MAGOH、EIF4A3、RBM8A）的敲除，仅特异性增加i12的比例，而对i23无显著影响（图3e）。这一结果直接证明剪接异构体的稳定性受其结构特征与降解通路的协同调控。

SF3B1是癌症中最常见的剪接体突变基因，而ReLiC发现其与SF3B5共同调控外显子跳跃，提示这些亚基的突变可能通过类似机制导致异常剪接。此外，NMD与剪接的偶联机制为理解“剪接异常如何引发mRNA降解”提供了直接证据，可能解释部分遗传病中基因表达量降低的原因。

图3.利用ReLiC进行异构体特异性剪接筛选

三、mRNA质量控制：NMD通路的翻译依赖调控

无义介导的降解（NMD）是细胞清除含PTC的异常mRNA的关键通路，其功能异常与癌症、神经疾病相关。传统观念认为NMD主要依赖RNA结合蛋白（如UPF家族），研究团队为此构建了两种β-珠蛋白报告基因：一种含PTC（提前终止密码子），另一种为NTC（正常终止密码子）。通过双条形码策略（报告基因与mCherry-puro标记共表达），可在同一细胞中归一化PTC/NTC的mRNA水平，排除细胞间差异的干扰（图4a）。在此基础上，结合化学修饰（ISRIB处理）和遗传修饰（GCN2敲除）筛选，解析NMD的调控通路。

关键发现：翻译起始因子与应激通路的交叉调控

1. NMD的翻译依赖性

筛选鉴定出90个基因敲除会显著升高PTC报告基因水平（FDR<0.05），其中除UPF1、SMG1等经典NMD因子外，近半数为翻译相关基因——包括核糖体蛋白、翻译起始因子（EIF2、EIF3、EIF2B）及氨酰-tRNA合成酶（图4b）。值得注意的是，EIF4F复合体（EIF4E、EIF4A）虽对翻译至关重要，却未被纳入关键调控因子，且化学抑制EIF4E仅轻微影响PTC报告基因水平，提示NMD对翻译起始因子的依赖具有特异性。

2. ER / 线粒体稳态通过 EIF2α 磷酸化调控 NMD

筛选发现，ER和线粒体蛋白（如HSPA5、HSPA9）的敲除会升高PTC报告基因水平。进一步通过ISRIB（一种抑制EIF2α磷酸化的小分子）处理发现，30个基因（包括上述ER/线粒体蛋白）的敲除对NMD的抑制作用，可被ISRIB逆转（图4c）。这表明，ER和线粒体应激通过激活EIF2α磷酸化（抑制翻译起始）间接抑制NMD，形成“细胞应激-翻译抑制-NMD减弱”的信号轴。

3. 氨酰-tRNA合成酶通过GCN2调控NMD

氨酰-tRNA合成酶的敲除也会升高PTC报告基因水平，而这一效应在GCN2敲除后消失（图4d）。GCN2是EIF2α的上游激酶，其激活会抑制翻译起始。这一结果证明，氨酰-tRNA合成酶功能缺陷通过“未充电tRNA积累→GCN2激活→EIF2α磷酸化→翻译抑制→NMD减弱”的通路发挥作用，揭示了氨基酸代谢与mRNA质量控制的跨界关联。

ReLiC的发现颠覆了“NMD是独立于翻译的RNA降解通路”的认知，证明其效率直接受翻译起始状态调控。这为理解肿瘤微环境（如营养匮乏）如何通过抑制翻译影响mRNA稳定性提供了新机制——例如，癌细胞可能通过激活GCN2-EIF2α通路同时抑制翻译和NMD，从而积累致癌性异常mRNA。

图4.采用化学基因组学方法中的ReLiC筛选技术进行解剖共译质量控制

四、药物应答：GCN1在抗白血病药物中的关键作用

化疗药物的疗效与细胞应激应答密切相关，但具体机制常不明确。高三尖杉酯碱（HHT）是一种靶向核糖体的化疗药物，通过结合大核糖体亚基抑制翻译起始。研究团队在表达EYFP报告基因的ReLiC细胞中，诱导Cas9表达7天后用HHT处理6小时，通过条形码测序分析基因敲除对EYFP mRNA水平的影响，以鉴定药物应答的关键调控因子（图5a）。

关键发现：GCN1通过感知核糖体碰撞调控应激应答

1. GCN1是HHT应答的核心因子

筛选中，仅GCN1敲除会显著升高HHT处理后的EYFP mRNA水平（FDR<0.05）（图5b）。GCN1是核糖体碰撞传感器，传统认为其通过激活GCN2调控氨基酸饥饿应答，而ReLiC筛选首次将其与药物诱导的核糖体应激关联。

2. GCN1抑制ZAK-p38通路与即刻早期基因（IEG）上调

机制研究显示，GCN1敲除会导致HHT处理后p38磷酸化显著增强（依赖于核糖体碰撞传感器ZAK），并伴随IEG（如FOS、JUN、MYC）的异常上调（图5d、e）。进一步分析发现，这些IEG的mRNA在5'UTR区域存在多个起始密码子，HHT处理会导致起始核糖体在此滞留，而GCN1的缺失会使滞留核糖体发生碰撞，激活ZAK-p38通路，最终引发IEG表达（图5g）。

3. GCN1功能的细胞类型保守性

在髓系白血病细胞系U937中，GCN1敲除同样会导致HHT处理后IEG的显著上调，证明这一机制并非局限于HEK293T细胞，可能与白血病治疗直接相关。

HHT是治疗慢性髓系白血病的一线药物，而GCN1的缺失会增强细胞对HHT的应激应答（如IEG上调），可能影响药物疗效。这提示GCN1或ZAK抑制剂可能通过减弱应激应答增强HHT的杀伤作用，为白血病联合治疗提供潜在靶点。

图5.GCN1调节细胞对抗白血病药物的反应

ReLiC技术通过将CRISPR扰动与条形码RNA报告系统结合，首次在基因组尺度上实现了对翻译、剪接、降解等RNA代谢过程的系统解析。其核心突破在于：

• 精准性：通过位点特异性整合和条形码标记，实现基因扰动与RNA表型的直接关联，避免传统筛选的假阳性；
  

• 灵活性：可结合多聚核糖体分级、化学处理等多种手段，解析不同RNA代谢过程的调控机制；