上期，给大家简单介绍了细胞学相关技术，从这期开始，我们将分别为大家详细介绍各种细胞学相关的实验技术。

秉持“少即是得”的原则，我们预定每一期只详细介绍一种技术，最终都汇集在CellMax细胞大课堂，为大家尽可能地提供方便。大家也可以在下方留言版块写下最希望了解的技术或者贡献您的宝贵意见，我们将为大家精心准备您想知道的一切~

这一期，我们将为大家介绍的是手工细胞计数法。因为在细胞培养技术中，细胞计数应是一项基本功，对于标准化培养条件以及需要精确定量的实验来说都非常关键。

下面即是手工细胞计数的基本流程、原理和意义：

1.计数前首先准备好细胞计数器（血球计数板）：

使用70%乙醇将盖玻片和细胞计数板清洁、晾干备用。
将晾干的盖玻片轻轻覆盖至血细胞计数器上。

（注：使用前须保证盖玻片和计数板已充分晾干，否则将影响后续细胞充池及计数结果。）

2.制备细胞悬液：

对于贴壁生长的细胞，我们需要首先使用胰酶消化的方法使细胞从培养皿表面脱落。（悬浮细胞则无需消化，稀释到合适倍数即可。）

然后加入适当的含血清培养基，中和胰酶的作用并重悬细胞，以得到均质的细胞悬液。要求尽可能将细胞吹散，不要残留任何细胞团，但不可用力过大。

（注：消化太过或消化不全均会使计数结果产生偏差。）

台盼兰染色（可选）：
如果需要计算细胞的活率，则需要将细胞悬液和0.4%台盼兰等体积混合；

室温孵育3-5分钟（悬浮细胞染色时间可视情况适当延长），使台盼兰完全进入死细胞，使死细胞着蓝色。

3.充池：即血细胞计数器加样

使用吸管或移液器将细胞悬液或细胞/台盼兰混合液滴加到计数池的边缘。此时液滴将在虹吸的作用下进入盖玻片下方的计数池，此即为充池。

（注：若需进行多个样品的计数，应尽量保证每次充池的体积一致，一般在10μl/池左右。）

以同样的方式在另一侧的计数池中也加入计数样品。

将计数板静置几分钟使细胞扩散、沉降。

4. 细胞计数：

在100倍显微镜下，移动计数板将视野对准计数板的中央大方块，该方块四周有一圈3条平行线包围，中间有密集的网格。中央方块区差不多刚好可以填满整个视野（图1中标记的3号位置）。

                     图1.细胞计数板图解

分别计数大方格1.2.4.5中的细胞数。（为降低计数误差，最好将细胞浓度调整为20-50个/大方格。）并重复记录另一侧计数池中的细胞数，总计8个大方块，然后取均值。

计数原则为：“数上不数下，数左不数右”。（判断标准为是否接触三条边线的中间线，如图2所示）。

                                      图2. 细胞计数原则

如果有多个细胞没有吹散而成团存在，此时只可记为一个细胞。如果团块很多，则需重新吹打甚至重新取样消化直至绝大多数细胞为单个细胞。

5. 细胞浓度计算：

                                             图3. 样品充池体积图解

由图3可以得出，每个大方格的容积为：

1 mm2×0.1 mm = 0.1 mm3 =10-4 cm3= 10-4 ml
即每个大方格的容积为万分之一毫升，因此在计算每毫升液体中的细胞数时需乘以104。

在常规没有使用台盼兰染色时，可以以下面公式计算每毫升样品中细胞的个数：
每毫升样品中细胞的个数 = 每个大方格内细胞的平均数 × 细胞稀释倍数×104

如果使用了台盼兰染色，还需要计算活细胞的百分率：
活细胞百分率（%）= 台盼兰拒染细胞数/总细胞数×100

此时活细胞数的计算公式为：
每毫升样品中活细胞的个数 = 每个大方格中细胞的平均数×活细胞比率×细胞稀释倍数×2×104
注：乘2是由于在台盼兰染色时，进行了等体积混合，相当于稀释了一倍。

看了以上步骤和原理，大家不禁会问：我们为什么要数细胞啊？细胞计数究竟有什么意义呢？其实，当我们想了解细胞的生长情况时，除了直接观察细胞形态以外，绘制细胞生长曲线、计算细胞倍增时间应该就是广泛采用的评价指标了。

所以尽管使用血细胞计数板手工计数细胞过程十分繁琐，对实验者操作者的要求也比较严格，现在也已有很多自动化的细胞计数器/仪，但对于科学研究中遇到的各种细胞而言，手工计数仍然是最简便易行的方法而被广大实验室采用。

好了，关于手工细胞计数方法就介绍到此，祝大家实验顺利~