IP/Co-IP的实验过程

      Co-IP可以寻找到抱在一起的两个蛋白分子，值得注意的是，Co-IP不能区分两个蛋白之间是直接接触、或是通过第三者做桥梁而间接接触。

      如图，A蛋白和B蛋白形成一个复合体结构，他们可以是直接抱团，也可以通过C分子作为桥梁，形成复合体。

IP/Co-IP 实验的重要原则

      首先，最重要的原则：保持Co-IP样品的一致性。一般来说，Input的误差控制在WB检出差异的范围以下。

      其次，要考虑buffer的盐离子浓度。通常来说，真实存在的蛋白复合体能耐受生理盐（0.15M）以及更高的盐浓度，即在生理盐浓度下不会解体。所以，一般不推荐使用盐离子低于0.15M的buffer，除非蛋白相互作用比较弱。

      另一方面，很多情况下，两个蛋白的相互作用的数据是通过过表达发现的。这时候，最好能做标签蛋白如GFP，flag等的knock-in的细胞，也可以在感染靶细胞时适当的降低慢病毒的感染滴度，使目的蛋白的表达水平维持在内源水平，在进行后续的Co-IP。

简化实验—提高IP检测效率的方法

       对内源蛋白的Co-IP实验，首先要确定手上的抗体是否工作。商品化的一些抗体官网说能够做IP，但在亲自测试的时候却不对。这时候，想必大多数同学都会怀疑自己的不好。以笔者经验来谈，最大可能就是抗体不好。此时，考虑换一个牌子的抗体是最好的，以免耽误实验进度，岁月不等人啊。其次，有时间的可以琢磨一下，是不是细胞没表达该抗原啊？是不是抗原是跨膜蛋白，在裂解细胞后不存在上清相中（这点可通过WB检测Input中是否存在目的蛋白来排除）？

      一个重要的考虑因素是蛋白的大小，尤其蛋白已知。当蛋白分子量接近55KDa或25KDa附近的时候，问题会比较复杂。因为在最后一步洗脱的过程，很容易将抗体的轻链和重链带入到IP终产物，它将严重干扰实验结果。

IP/Co-IP 的实验疑问解决方案

       1、 IP外源tagged蛋白，洗脱尽量用相应的peptide竞争洗脱。此外，Flag、HA-beads通常是鼠抗，那么WB选用的蛋白的抗体应该选用非鼠抗—即选择异种抗体配合IP/WB实验。

       2、 IP内源性蛋白，尤其最后涉及低pH Glycine-HCl洗脱或者SDS LB煮beads（后者抗体的重、轻链会更严重被洗脱），如蛋白为60KDa即能与55KDa重链分开时，且抗体效价许可的前提下，降低Co-IP实验中抗体投入量会显著减弱重、轻链信号，从而不会使得B蛋白信号在WB显影过程中被重链信号吞没；配合异种来源的抗体用作下游WB实验，即Co-IP 中使用的抗体为兔抗时，下游WB 实验蛋白选用非兔抗，如鼠抗、羊抗；反之亦然。笔者之前证明某蛋白与微管蛋白tubulin相互作用的实验中，由于tubulin分子大小在55KDa附近，完美的与抗体重链重合，试过用轻链特异的二抗来解决这个问题，但都失败了。最后，就是换用异种来源的抗体配合WB实验，解决了重链干扰问题。所以，强烈推荐此方法。

       其他一些问题如beads的封闭等也很重要，但都相当琐碎。这些琐碎的事就交给雅酶吧！相信小伙伴们在充分理解以上几点后，配合雅酶的经典Protein A/G IP/Co-IP kit，在以后的实验中可以做到百战百胜。雅酶现在推出的这款Protein A/G IP/Co-IP kit，完美解决了buffer、磁珠等的优化问题，能胜任大多数IP/Co-IP实验。效果媲美进口的同类型kit，价格优美。

IP/Co-IP 产品信息一览表

                                              ※即日起：凡定购雅酶任意IP-CoIP试剂盒均赠送雅酶1.5/2.0ml 16孔磁力架一个！

实验效果

雅酶 Protein A/G 磁珠与 β-catenin 抗体结合，将 β-catenin 蛋白及其结合蛋白 TCF-4 捕获。

阳性对照组(Input 组) 为直接利用兔抗 β-catenin 抗体(或鼠抗 TCF-4 抗体)对细胞裂解液进行 WB 检测；阴性对照组（IgG 组）为正常兔 IgG。