冷冻保存细胞并创建自己的生物样本库是每个研究人员都需要经历的问题，无论是细胞株还是原代细胞，抑或是用于再生医学的间充质干细胞，冷冻保存可确保再生医学应用的高质量细胞随时可用。它允许标准化并减少对新鲜细胞分离的依赖。

将冻存管、离心管、移液管等耗材准备齐全，放入超净台中，打开紫外线照射30分钟进行消毒。同时，打开通风机通风3分钟，并用75%酒精擦拭操作台和双手，确保操作环境的无菌状态。此外，还需准备好冰盒，以及预热至37℃的完全培养基、DMSO、胰酶等试剂。

① 选择处于对数生长期、致密度约为80-90%、活力达90%以上的细胞进行冻存。细胞活力差的细胞在冻存后的成活率很小，因此一定要在细胞旺盛分裂时期冻存。② 取出细胞，进行酒精消毒后放入超净台。按照细胞传代步骤，对细胞进行消化、解离。消化好的细胞离心后，弃掉上清液。

① 配置细胞冻存液，常用比例为无血清培养基：血清：DMSO=7：2：1，或含20%血清培养基、10%DMSO。DMSO应为试剂级等级，无菌且无色，可以用0.22微米滤膜过滤，或直接购买无菌产品。冻存液应提前配制，防止临时配制产生的热量损伤细胞。

② 用冻存液重悬细胞，用移液器轻柔吹打细胞，避免损伤细胞。同时，混匀DMSO要快，因为DMSO对细胞有毒性，混合后应尽快冻存。

① 按照-4℃30分钟、-20℃30分钟、-80℃过夜、液氮保存的顺序进行冻存。

② 细胞冻存是慢冻的过程，目的是使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶从而降低对细胞的伤害。对于大多数细胞来说，每分钟降1-3℃是标准的降温方法。

① 细胞冻存液需提前配制，不可直接将DMSO加入细胞悬液中；

② DMSO本身就有灭菌的作用，因此使用前不需要进行高压灭菌。高压灭菌反而会破坏它的分子结构，降低冷冻保存效果。

③ 应选择对数期生长，细胞汇合度80%-90%左右的细胞进行冻存操作，确保细胞冻存时状态最佳，冻存密度可根据细胞特性进行调整；

④ 程序降温盒和常规冻存液需室温备用，完全培养基、胰酶和PBS需37℃预热；

⑤ 冻存前注意切勿消化时间过长、吹打力度过重、离心转速过大或离心时间过长，以免造成细胞损伤；

⑥ 细胞不可长期保存在-80℃冰箱中，建议在-80℃冰箱中的保存时间不要超过48小时，然后尽快转移至液氮中长期保存；

⑦ 冻存管的盖子一定要拧紧，否则水浴复苏时水会渗入造成污染。

⑧若没有程序降温盒，则按下列顺序依次降温：室温→4℃ 20min→-20℃ 30min→-80℃过夜→液氮保存，注意转移过程中要保冷，避免产生温差或冻存管融化。