sgRNA pool构建流程
| CRISPR Screening基因组合的确定
sgRNA全基因组文库由于基因数量过多,通常很难获得较好的文库筛选结果。权阳生物建议根据自身的研究方向定制或者购买符合需求的sgRNA亚文库现货,建议基因数量选择在500-2000之间,sgRNA条数每个基因选择5-10条,这样大小的文库更容易得到理想的实验结果。
那么如何选择sgRNA亚文库,通常可结合自身的研究方向选择已有的现货文库,该方式的性价比最高,例如权阳生物目前已经构建完成了RBP/泛素化/转录因子/膜蛋白/表观遗传等相关的CRISPR-cas9 sgRNA libarary,这些文库可以快速运营用相关的课题研究。
但已有的现货文库缺少个性化属性,通常发文也有受到一定的限制!可根据自身的课题方向,结合临床样本的转录组分析结果,制定一个个性化的基因List,再构建至最符合需求的载体上,获得高度定制化的sgRNA 文库,从而完成进行体内外的基因高通量研究,是当下最理想的实验方案。
| sgRNA pool 的设计
| sgRNA pool 的 oligo 的设计
我们以cas9-sgRNA靶点TTCGCACGATTGCACCTTGG为例,引物序如下
CTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCG-TTCGCACGATTGCACCTTGG-GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGG
| sgRNA pool构建步骤
a. 载体处理
b. sgRNA oligo pool的合成
sgRNA oligo pool 是通过芯片引物合成仪器合成的,oligo池的质量也是决定文库质量的重要因素,因此oligo池在合成之后,我们都通过NGS对其进行QC验证。
c. sgRNA oligo pool的扩增
芯片合成的oligo pool是极微量的单链DNA,通常需要进行PCR扩增获得足够量的双链DNA产物,用于后续和载体的无缝链接。以下述CAS9-sgRNA文库的序列为例CTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCG-TTCGCACGATTGCACCTTGG-GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGG的扩增引物
sgRNApool-F:CTTTATATATCTTGTGGAAAGGACG
sgRNApool-R:CCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCT
d. 链接小试
e. 大体系链接及电转
f. 质粒大抽
g. NGS测序
利用FastNGS测序平台,可以快速检测并分析sgRNA文库的靶基因丰度和平衡性。大大缩短了文库的验证周期。
| 文库合格指标
(1) 覆盖度大于95% : 过滤后最终得到的sgRNA数占sgRNA参考序列数百分比,如果覆盖度越接近100%,说明文库质量越高;
a. 病毒包装
b. sgRNA细胞/组织文库的构建
通常sgRNA文库使用慢病毒递送的方式较多,包装好的sgRNA文库慢病毒,需要在293T细胞测试其滴度,再感染目的细胞构建细胞文库。通常控制感染比例在30-50%之间为最佳,即MOI大致为0.5,这里的MOI 0.5指的是目的细胞的感染复数,大多数细胞的感染难度要远高于293T细胞,因此构建细胞文库前,必须要测试病毒在目的细胞的MOI。低MOI感染的目的是尽量让每个细胞中只有一个sgRNA序列被插入,这样更方便后续的表型分析。
c. aav病毒载体的sgRNA文库,通常运用于体内感染,一般会选择Cre-Loxp的Crispr小鼠模型进行实验,结合特异性启动子表达CRE酶,实现在特定组织上的CRISPR screnning。